脂肪酶前处理油脂的效果及其对肉鸡生长性能的影响

2016-01-09李路胜徐志祥冯定远吴广兵龚俊勇左建军

饲料工业 2016年14期

■ 李路胜徐志祥冯定远徐梅马岩郑涛吴广兵龚俊勇左建军

（1.聊城大学农学院，山东聊城 252000；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；3.深圳市绿微康生物工程有限公司，广东深圳 518055）

脂肪是畜禽营养需要中的主要供能物质，但家禽对脂肪的消化还受到多种因素的影响，包括家禽品种、脂肪酸类型、日粮营养水平、抗营养因子、食糜黏度等。脂肪酶的活性也受到各种内源因素的影响，包括胆盐、pH值、糜蛋白酶等（张镇福等，2001；Nahashon等，2005；李勇等，2010；刘梅，2011）。肉鸡生长早期或应激条件下内源脂肪酶的不足导致脂肪消化受限，为添加外源脂肪酶提供了依据。叶慧等（2013）研究发现，添加脂肪酶能够促进黄羽肉公鸡发育，显著增加平均日采食量和平均日增重，降低后期和全期料重比（P＜0.05）。脂肪酶的应用多是直接添加于畜禽饲料中，这必然面临两个问题：一是加工处理对脂肪酶活性的影响；二是局限于畜禽动物肠道环境的影响，脂肪酶不能最大化发挥酶解效应。理论上，油脂在体外经脂肪酶水解处理后可起到前消化作用，提高饲料中利用效率，进而提高饲料中油脂有效能值。赵海珍等（2005）通过脂肪酶体外处理猪油，改良制备出了功能性脂。

目前，脂肪体外酶解处理多应用于工业和食品等领域，至今未见针对饲用脂肪酶解前处理技术的开发和应用。所以，本研究预计通过筛选并建立饲用油脂体外脂肪酶水解工艺参数，结合动物代谢和饲养试验系统评估体外油脂脂肪酶水解处理对油脂能量价值以及其应用于动物饲养后对肉鸡生长性能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验用脂肪酶及油脂

微生物脂肪酶由某酶制剂公司提供，来源于黑曲霉；酶活力测定值为1 599.84 U/g；猪油由广州至润油厂提供。

1.2 脂肪酶体外水解天然油脂工艺参数筛选及其水解效果的测定

1.2.1 猪油酶解反应及其条件

在贝塞瓶中加入1 g油脂（精确至0.000 1 g）、不同pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）的50 mmol/l的Tris-HCl溶液5 ml、不同体积（1、2、3、4 ml）的脂肪酶溶液，在30、35、40、45 ℃水浴振荡（150 r/min）反应90 min。其中，pH值为7.0、2 ml脂肪酶液（即32 U/ml）、40 ℃为基础参考处理参数。在此基础上，旋转水浴锅中以150 r/min处理 24 h。

1.2.2 脂肪酸萃取

在混合反应液中加入5 ml石油醚，充分振荡后静置10 min，然后转入50 ml离心管5 000 r/min离心10 min。

1.2.3 脂肪酸甲酯化

吸取离心上清有机液1 ml，加入5 ml 1%H2SO4-甲醇溶液，70℃水浴反应60 min，为防止溶液蒸发，在瓶口设置简短的回流管。

待溶液反应结束，冷却后加入2.5 ml异辛烷和0.5 ml内标溶液混匀，随后加入7 ml饱和NaCl溶液振荡3 min，5 000 r/min离心10 min后吸取上层液备用。

1.2.4 气相色谱仪测定

按照国标《GB/T17377—2008动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析》步骤操作。

色谱柱：Nukol毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱温：程序升温，初始温度80℃保持5 min，以10℃/min速率升至170℃，保持10 min，再以10℃/min速率升至195℃，保持10 min；进样口温度：220℃；检测器温度：250℃；载气为高纯氮气；柱前压：100 kPa；燃烧气氢气70 kPa，助燃气空气50 kPa；分流进样方式，分流比为1∶20；进样量为1 μl。

组分峰面积由GCSolution软件计算。

式中：ρ——样品中脂肪酸含量（g）；

A1、A2——分别为样品中脂肪酸组分与内标峰面积；

A'1、A'2——分别为混标溶液中脂肪酸组分与内标峰面积；

ρ'——混标溶液中各脂肪酸甲酯含量（g）；

n——浓缩倍数。

1.2.5 猪油酶解反应的水解率的计算

式中：ρi——各种脂肪酸含量（g）；

w ——油脂含量（g）。

1.3 脂肪酶对体外水解油脂有效能值的影响

体外脂肪酶不同条件水解处理后猪油的代谢能值测定过程参照Sibbald TME法进行。

1.3.1 动物分组及试验设计

选取体况相近体重在2.5 kg左右的成年公鸡为试验动物，40只，随机分配到4个处理，分别为A、B、C、D组。A和B为试验组，C组为绝食组，D组为对照组。A组饲喂使用在筛选出最佳体外脂肪酶水解条件下处理后猪油的饲粮，B组饲喂使用未经过酶解处理猪油的饲粮，C组为绝食处理，D组饲喂基础饲粮。

1.3.2 试验饲粮

根据中国肉鸡饲养标准（2004）的营养需要，设计各原料配比，计算出各原料配方。根据配方用精度0.5 g的天平称量各原料。基础饲粮具体配方见表1。

表1 基础饲粮配方

待测饲粮在基础日粮基础上，用13.44%的猪油替代基础饲粮（即100 kg试验饲粮中，基础饲粮占86.56 kg、猪油占13.44 kg），猪油来源的ME占总待测饲粮ME的34.03%。

1.3.3 饲养管理及样品采集

公鸡适应期为5 d，各组都饲喂基础饲粮；预试期3 d，预试期后禁饲排空期36 h后，A、B组强饲60 g（精确至0.000 2 g）使用不同猪油的待测饲粮，C组绝食，D组强饲60 g（精确至0.000 2 g）基础饲粮，排泄物收集期为36 h，同时采集试验日粮样品。样品处理按常规代谢试验规程操作。

1.3.4 试验测定指标及方法

试验饲粮中水分含量的测定：根据GB/T 6435—2006规程测定。试验饲粮和排泄物的能量测定：采用德国IKA全自动氧弹计测定。试验饲粮和排泄物粗脂肪测定：采用粗脂肪提取仪测定。

饲粮的TME值可依据以下公式计算得出：

式中：GE——摄入饲料的总能（Gross Energy，MJ）；

FE——排泄物的粪能（Energy in Feces，MJ）；

GF——摄入饲料的质量（kg）；

t——采食饲料鸡（只）；

f——绝食鸡（只）。

油脂的TME可依据以下公式计算得出：

TME油=（TME试验饲粮-TME基础饲粮×基础饲粮比例）/待测油脂比例。

1.4 酶解猪油与脂肪酶对肉鸡生长性能的影响

1.4.1 饲养试验设计

选取700只42日龄黄羽肉鸡，共分成4个处理组，其中每个处理设5个重复，每重复35只鸡（公鸡18只，母鸡17只）。处理1为正对照组（饲喂基础日粮）；处理2为负对照组（饲喂日粮能量在基础日粮水平上降低0.5 MJ/kg）；处理3为脂肪酶体外水解处理猪油日粮组，即使用脂肪酶体外水解后猪油的低能日粮组；处理4为负对照组+35 000 U脂肪酶/kg猪油。猪油经过融化后用20 kg玉米粉吸附混合均匀后加入全价日粮中。

1.4.2 日粮配方和营养水平

试验日粮参照中国肉鸡饲养标准（2004）设计，日粮配方和营养水平见表2。

1.4.3 饲养管理

黄羽肉鸡由广东粤禽育种公司提供，试验期为21 d，即42～63日龄。全期自由采食、饮水，采用24 h光照制，免疫及饲养管理均按照常规管理程序进行操作。

1.4.4 生长性能

于第63日龄时以重复为单位对全群试验鸡进行空腹称重（空腹期8 h，断料不断水）并统计用料量。以重复为单位，计算各处理组平均日采食量、42～63日龄的平均日增重和料重比。

1.5 脂肪酶对肉鸡屠宰性能的影响

参照全国家禽育种协会公布的《家禽生产性能名词术语和度量统计方法1984》进行屠宰测定。

于第63日龄时，每个重复随机选取2只接近平均体重的健康受试鸡，记录其活体重、胴体重量、半净膛重和全净膛重，并分离单侧腿肌、胸肌和腹脂，记录重量。

屠宰率（%）=胴体重量/畜禽活重×100；

半净膛率（%）=半净膛重/宰前体重×100；

全净膛率（%）=全净膛重/宰前体重×100；

腿肌率（%）=两侧腿肌重/全净膛重×100；

胸肌率（%）=两侧胸肌重/全净膛重×100；

腹脂率（%）=腹脂重/（全净膛重+腹脂重）×100。

表2 基础日粮配方及营养水平

1.6 数据处理与统计分析

试验数据用Excel 2007软件进行初步分析后，使用SPSS18.0软件进行单因素方差分析并用邓肯氏新复极差法进行多重比较（P＜0.05为差异显著）。试验结果采用“平均数±标准误（M±SE）”表示。

2 结果与分析

2.1 脂肪酶体外水解猪油的适宜工艺参数及其水解效果（见表3）

由表3可知，在pH值为碱性条件下的油脂水解率较高，其中pH值为8.0时达到78.62%；反应温度为30～40℃范围内，脂肪酶水解猪油的效率均达到60%以上，其中40℃条件下可达到76.54%的水解率；随着脂肪酶添加量的增加，猪油水解效率增加，其中添加量达到3 ml和4 ml（即48 U/g猪油和64 U/g猪油）时，水解率分别达到79.61%和81.43%。

表3 不同反应条件下脂肪酶对猪油的水解率

以最大水解效率为脂肪酶体外水解猪油反应条件筛选的依据，本试验条件下适宜的工艺参数为：pH值8.0、反应温度40℃、脂肪酶添加量64 U/g猪油。

2.2 脂肪酶对体外水解油脂有效能值的影响

脂肪酶体外水解猪油对其代谢能值影响的结果见表4。由表4可知，猪油体外脂肪酶处理之后的TME获得了显著提高，提高了4.81%（P＜0.05）。

表4 脂肪酶前处理对猪油及其TME的影响

2.3 脂肪酶对肉鸡生长性能的影响（见表5）

表5 脂肪酶对42～63 d黄羽肉鸡生长性能的影响

由表5可知，降低肉鸡日粮能量水平降低了其日增重（P＞0.05）和饲料报酬（P＜0.05）；使用脂肪酶体外水解油脂替代未经过处理油脂后显著提高了肉鸡采食量和日增重，相对处理2组的提高幅度分别达到5.10%（P＜0.05）和10.11%（P＜0.05）的改善效果。直接添加脂肪酶对肉鸡日采食量和日增重提高效果显著（P＜0.05），但对料肉比影响不显著（P＞0.05）；使用酶解处理油脂或直接添加脂肪酶均改善了采食低能量日粮肉鸡生长性能，其生长性能可达到甚至数值上超过正常能量日粮组肉鸡的生长性能。

2.4 脂肪酶对肉鸡屠宰性能的影响（见表6）

表6 脂肪酶对63 d黄羽肉鸡屠宰性能的影响（%）

由表6可知，脂肪酶前处理油脂使用或直接在日粮中添加脂肪酶对肉鸡屠宰性能的影响均不显著（P＞0.05），且降低能量组相对正常能量组的差异也不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 脂肪酶前处理油脂的方法及其效果

脂肪酶在动物日粮中添加效果受到很多因素的影响，包括饲料加工制粒对脂肪酶活力的影响、消化道内环境对脂肪酶活力的影响等。所以，避开饲料加工以及消化道内环境的条件限制，利用饲用酶制剂在体外对饲料原料进行前处理，提高饲料可利用营养价值的技术思路具有重要的科学和实践意义。而且，体外条件下，可根据酶的适宜反应条件的需要，灵活设置反应环境，最大化发挥酶的作用效率。

酶制剂前处理油脂的研究和应用主要在食品方面开展了大量工作。宋少芳等（2006）利用脂肪酶催化α-2单硬脂酸甘油酯水解反应活性的研究时发现，凝胶组成为微乳液配比为m（正庚烷）∶m（缓冲液）∶m（AOT）=75∶9∶16，明胶质量分数为17%，R值为72；酶含量固定，底物浓度大于0.10 mol/l时，脂肪酶可发挥最大催化活性；而且，反应时间超过15 h，水解反应达到平衡。陈少欣等（1995）筛选出游离酶最佳催化条件为pH值9.6、33℃、底物浓度25%时，水解率可达85.7%，此时游离脂肪酶动力学参数Vm和Km值分别为5.56μmol/（ml·min）和6.2×10-2（V/V）。在充分平衡各方面条件要求下，选择适宜的工艺条件，油脂的水解率可达到90%～98%（高昆玉等，1992）。本试验中，采用单因素分别筛选适宜体外酶解反应pH值、温度和酶添加剂量获得的适宜反应参数分别为pH值8.0、温度40℃、酶添加剂量为64 U/g猪油，在此条件下获得的猪油水解率达到80%的水平，这低于食品方面的报道结果，可能的原因是单个适宜参数组合之后可能出现组合效应下降的问题。

针对体外酶解反应条件的筛选，常用的方法除了单因素分别筛选之外，常用的方法还有响应面分析法（RSM）。RSM是一种有效的处理复杂数据的统计方法，它也是一种最优化的方法，它将体系中的响应作为一个或多个因素的函数，并能运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。响应面分析法最主要的优点在于能够减少试验次数并能得到足够的统计学数据。目前，响应面分析法广泛应用于各种水解反应和生物柴油的体外酶解反应参数筛选合成反应，以及食品和饲料酶制剂产品和加工工艺的优化（Wang等，2008；Rodrigues等，2011；雷建平，2012）。

3.2 脂肪酶对肉鸡生长性能的影响

一般脂肪可提供相当于碳水化合物2.25倍的能量。添加脂肪可以较小的配方空间来提供较高的能量浓度满足部分家畜对高能量的需求，能够提高其他营养成分浓度；同时油脂还具有热增耗低、抗热应激的特点。除了提供能量、提供必需脂肪酸等直接营养作用之外，油脂还具有特有的其他作用：①间接营养作用：提高脂溶维生素、色素利用；②非营养作用：润滑机械，减少粉尘。基于上述优点，加上肉鸡生长速度快，需要能量浓度高，油脂在肉鸡日粮的使用已经成为不可或缺的原料之一。但是，在添加油脂的同时也带来了脂肪过度沉积导致脂肪浪费和肉品质下降的问题（李娟娟等，2008）。脂肪的消化必须有脂肪酶的催化，而且现代肉鸡养殖的高强度、多应激问题导致肉鸡难于满足高油脂日粮的脂肪消化和利用需要。如颜士禄等（2009）研究表明，不管是AA肉鸡还是北京油鸡都在生长早期和应激条件下普遍存在内源脂肪酶分泌不足的问题。所以，外源性脂肪酶添加非常必要性。

Tan等（2000）报道，在含高油玉米、全脂米糠、干苜蓿粉、饼粕等的饲粮中添加脂肪酶，可提高猪、禽表观消化能5%～11%，提高日增重4%～10%，提高饲料转化率2%～7%。叶慧等（2013）研究发现，日粮中添加脂肪酶35 000 U/kg猪油能够促进黄羽肉公鸡发育，显著增加平均日采食量和平均日增重，降低后期和全期料重比（P＜0.05），且降低后期黄羽肉公鸡血清中总胆固醇和高、低密度脂蛋白的含量（P＜0.05）、提高高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比值，不同程度地影响了黄羽肉公鸡胸肌干物质中蛋白质和脂肪的含量；结果提示，添加脂肪酶能够改善黄羽肉鸡生长性能和脂质代谢，并且影响胸肌营养成分的沉积。本试验条件下，不管是使用酶解处理油脂或直接添加脂肪酶均改善了采食低能量日粮肉鸡生长性能，其生长性能可达到甚至数值上超过正常能量日粮组肉鸡的生长性能。外源性脂肪酶可提高饲料中的脂肪消化率，特别是可显著提高米糠中的脂肪消化率，因而可提高米糠的表观代谢能值和饲料转化率（Pluske等，1997）。本研究在体外通过脂肪酶处理猪油发现，其肉鸡TME值提高了4.81%（P＜0.05）

脂肪酶提高动物生长性能的可能作用机制主要体现在以下几个方面：①弥补内源脂肪酶不足，促进脂肪消化吸收（Pratuangde等，2000）；②调节CCK分泌，影响胰腺消化酶分泌和采食（Tanaka等，2008）；③与油脂协同作用，抑制肠道内有害病菌繁殖（Dierick等，2004）；④改变脂肪水解产物，影响体内脂质代谢（Iqbal等，2009）。