青贮苜蓿中抑菌活性乳酸菌的筛选及鉴定
2016-01-09李东霞杨富裕王雁萍杨慧晓郭琳娜
■李东霞 杨富裕 王雁萍 杨慧晓 郭琳娜 王 雨
（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.郑州大学离子束生物工程省重点实验室，河南郑州 450052；3.北京助尔生物科学研究院，北京 100085）
苜蓿（Medicago sativa L.）产草量高，营养丰富，是许多国家主要的饲料作物。随着我国畜牧业的快速发展，苜蓿已成为不可替代的保障饲草[1]。国内市场的优质苜蓿产品一直处于供不应求的状态，苜蓿进口量逐年增加。自2012年中央推行“振兴奶业苜蓿发展行动”以来，我国苜蓿种植面积迅速扩大，苜蓿产量也大幅度提高[2]。提高苜蓿贮存技术，改善苜蓿储藏品质，保障优质苜蓿产品饲喂家畜对我国畜牧业发展具有重要意义。
近年来，将青贮技术应用于苜蓿贮存在世界各地得到普遍的应用和推广[3]。在青贮发酵过程中，乳酸菌发酵糖类产生有机酸及其它抑菌物质，抑制不良菌群的繁殖，从而使饲草营养物质得以保存[4-5]。为了提高青贮效果，各种乳酸菌添加剂被广泛应用在青贮饲料的制作中，但是不同来源的乳酸菌对苜蓿这种饲草的适应性不同，进而会影响苜蓿青贮的效果[6-8]。考虑到苜蓿自然附着的乳酸菌含量很少[9]，但在青贮过程中，适应其生存环境的乳酸菌会保留，与杂菌竞争养分进而大量繁殖。因此本研究以苜蓿自然青贮过程中存在的乳酸菌为筛选来源，以期从中找出适合苜蓿材料特点，抑菌活性强的菌株，为进一步研究开发针对苜蓿青贮的乳酸菌添加剂提供优良菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 青贮样品
选取河南省郑州市郊区两种紫花苜蓿品种：标杆，WL343。在初花期收割，室内晾晒8 h后，用铡刀铡至段长2～3 cm，分别装入10个聚乙烯袋，每袋100 g，用真空包装机抽真空并封口。在青贮前及青贮第3、5、10、15、30、60 d时分别取样进行乳酸菌的分离。
1.1.2 指示菌
枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌，均为郑州大学离子束实验室保存。
1.1.3 试剂及培养基
蛋白酶K、API 50 CH试剂条、MRS培养基、NA培养基。
1.2 方法
1.2.1 青贮样品中乳酸菌的分离及抑菌活性乳酸菌的筛选
将10 g青贮样品加入到90 ml无菌水中，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基，30℃厌氧培养48 h后从中挑取单菌落，划线纯化2次，经革兰氏染色和过氧化氢酶试验，挑出革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株，通过牛津杯双层平板法对从青贮材料中分离到的乳酸菌进行抑菌试验[10]。
1.2.2 乳酸菌菌株抗菌活性物质初步分析
试验检测了高抗菌活性乳酸菌菌株发酵上清液对温度、pH值、蛋白酶的敏感性[11]。并通过高效液相色谱法分析培养24 h后乳酸菌发酵液中的主要有机酸成分，每株菌分别设三个重复。
1.2.3 乳酸菌的鉴定
根据乳酸菌生理生化特性、API 50碳源发酵结果以及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定[12]。
2 结果与分析
2.1 苜蓿青贮样品中乳酸菌的分离
本试验通过半选择性MRS培养基，从不同青贮时间的苜蓿样品中分离得到104株革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性的乳酸菌菌株。
2.2 乳酸菌的筛选
104株乳酸菌菌株其中有81株对4种指示菌均有不同程度的抑制作用，从中挑选出2株抑菌效果较强的菌株，分别是在青贮前分离到的菌株ZZU a10和青贮60 d分离到的菌株ZZU a200。表1显示这两株菌对指示菌均有很好的抑制效果。
表1 乳酸菌的抑菌活性
2.3 乳酸菌菌株抗菌活性物质的初步分析
乳酸菌发酵上清液在不同处理下对指示菌的抑菌活性如表2所示，不同温度对两株菌的作用不同，ZZU a10的抑菌活性随着温度的升高呈现下降趋势，而ZZU a200的抑菌活性并没有受到温度升高的影响；两株乳酸菌的抑菌物质对温度的敏感性差别说明其抑菌物质不同。在对两株菌的发酵上清液调至不同pH值处理后发现两株菌在酸性环境中均有较强的抑菌活性，且随着pH值的升高，抑菌活性呈下降趋势；但ZZU a200相对于ZZU a10对pH值更加敏感，其在发酵液pH值调至6.0时对四种指示菌的抑制作用完全消失，而ZZU a10在pH值8.0时依然有明显抑菌活性；pH值敏感性差异进一步说明两株菌的抑菌物质不同，ZZU a10的抑菌物质能够耐受中性甚至弱碱性环境，而ZZU a200的抑菌活性只能在低pH值下发挥作用，推测ZZU a200的抑菌物质主要是菌株代谢产生的有机酸。蛋白酶K处理结果显示，其对ZZU a200的抑菌活性没有影响，ZZU a10的抑制作用完全消失，说明ZZU a10发挥抑菌活性的物质是对蛋白酶敏感的蛋白类物质，推测是一种细菌素。
利用高效液相色谱法测定ZZU a10及ZZU a200发酵上清液中有机酸的含量，结果如表3所示，这两株菌有机酸产物中均含有乳酸、乙酸成分，而且乳酸含量最多，其次是乙酸，ZZU a200的发酵液中还含有少量丙酸；两株乳酸菌均没有检测到丁酸成分。ZZU a200的各种有机酸含量均显著高于ZZU a10（P＜0.05）。
表2 乳酸菌的抑菌活性
表3 发酵液中有机酸的产量（mg/ml）
2.4 乳酸菌菌株鉴定
如表4所示，这两株乳酸菌都是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性。ZZU a10为球菌，而ZZU a200为杆菌；两株菌都能在3.0%(W/V)的NaCl浓度生长，ZZU a200甚至能够耐受6.5%(W/V)的NaCl浓度。两株菌均可以耐受10℃低温，ZZU a200甚至可以耐受50℃的高温。两株菌可以耐受pH值4.0～9.0的范围，ZZU a200在pH值3.0的酸性环境中依然可以良好生长。
表4 菌株形态及生理生化特性鉴定结果
由表5可知，菌株ZZU a10可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等17种碳源，对山梨醇、拢牛儿糖有微弱利用；菌株ZZU a200能够利用的碳源较多，共24种，对鼠李糖、拢牛儿糖也有微弱利用。
将两株乳酸菌测得的16S rDNA序列递交到Gen-Bank，使用程序Blast来找寻与其有最大同源性的序列，并与检测得到的标准菌株序列信息通过CLUSTAL W软件比对。采用邻接法构建进化树（neighborjoining method），如图1及图2所示，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis被用作外围菌株。
结合生理生化试验，碳源发酵结果及16S rDNA序列结果分析，ZZU a10被鉴定为Enterococcus mundtii；ZZU a200被鉴定为Lactobacillus plantarum。
3 讨论
在饲料中添加具有抑菌作用的乳酸菌除了能够抑制杂菌的繁殖，降低饲料营养损失外，被家畜采食后还有助于维持肠道内菌群平衡。乳酸菌抑制杂菌的方式主要是其代谢产物中含有抑菌物质，包括有机酸及蛋白类细菌素等[13]。
表5 碳源发酵试验结果
图1 ZZU a10的16S rDNA序列系统进化树
图2 ZZU a200的16S rDNA序列系统进化树
试验结果显示，ZZU a10的抑菌物质主要为蛋白类物质，且与前人报道的细菌素情况一致，推测是一类细菌素[14]。细菌素的抑菌效果受到许多因素的影响，如温度、pH值等[11,15-16]。温度过高会改变细菌素分子结构，抑菌活性也会随之降低，甚至丧失；研究表明，ZZU a10的抑菌物质具有很好的热稳定性，在100℃处理30 min的条件下依然有抑菌效果。对pH值而言，细菌素发挥抑菌作用需要在适宜的pH值范围内，pH值过低或过高同样会影响细菌素的结构，引起抑菌活性的降低或丧失[17]。常见的细菌素Nisin在低pH值下有很强的抑菌活性,但在pH值高于7.0时活性丧失[18]。本实验筛选到的ZZU a10产生的抑菌物质在pH值2.0～8.0范围内均有明显的抑菌活性，说明其具有更广的环境适应性。
研究表明，菌株ZZU a200发挥抑菌作用的主要成分为有机酸；有报道指出乳酸菌代谢产物中的有机酸对索氏志贺菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单增生李斯特菌均有明显抑制作用[19-20]。与之相似，ZZU a200对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌有较强的抑制作用。实验经过高效液相色谱分析发现，ZZU a200有机酸含量丰富。有机酸的抑菌机理主要包括两种，第一是有机酸可以降低其它杂菌细胞间质的pH值，破坏其渗透压体系，使得细胞消耗更多的能量来维持平衡，进而抑制杂菌的生长和繁殖；第二是酸性物质破坏杂菌的细胞膜，进入其细胞内，抑制某些大分子如DNA、RNA、蛋白质或脂类的合成代谢，干扰杂菌体内正常的生命活动，最终达到抑菌效果[21]。有研究表明，乳酸菌有机酸发挥抑菌作用具有较强的热稳定性，在100℃的处理后，依然保持处理前92%以上的抑菌效果[22-23]。本研究结果显示，ZZU a200的发酵液在100℃处理30 min后能够保持与处理前一样的抑菌效果，说明该菌株能够耐受高温的环境发挥抑菌活性；且该菌株表现出良好的理化性质，能够耐受高温（50℃）、高盐（6.5%）浓度，可利用的碳源范围广泛，说明ZZU a200具有较强的生存适应性。其在苜蓿青贮中的添加效果有待进一步研究验证。
4 结论
从苜蓿青贮过程中分离到104株乳酸菌并筛选到两株具有高抗菌活性的菌株——ZZU a10及ZZU a200，ZZU a10被鉴定为Enterococcus mundtii，发挥抑菌活性的主要成分为蛋白类物质，ZZU a200被鉴定为及Lactobacillus plantarum，发挥抑菌活性的主要成分为有机酸。两株菌的抑菌物质分别在pH值范围、温度范围表现出广泛的耐受性，菌株ZZU a200在不同的温度、pH值、盐浓度环境下还表现出较强的生存适应性。以上结果表明，这两株菌在苜蓿饲料青贮中具有潜在应用价值。
