益生菌肠道黏附性研究进展

■丁素娟 王薇薇 李爱科 周 航 王永伟 王 丽 宋 丹 方 俊

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.国家粮食局科学研究院，北京 100037）

动物肠道内约有30个属达500余种细菌，主要为厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌，其中专性厌氧菌达99%以上。肠道微生物大致可以分为三大类，第一类是有益菌，它是机体不可缺少的益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等；第二类是有害菌，这类菌达到一定的数量就会致病；第三类是具有双重作用的中性菌，这类菌在正常情况下是有益的，一旦增殖失控或从肠道转移到身体其他部位，可能会致病，如大肠杆菌、肠球菌等。按照黏附性分类，可分为黏附菌和过路菌。黏附菌是指能在机体肠道内定植一定时间的细菌，发挥重要的生理作用。过路菌一般属于肠道内的次要菌群，流动性大，具有潜在的致病性，有的潜在致病。黏附是微生物定植于宿主肠道上皮过程中的第一步。益生菌只有黏附于宿主肠道上皮细胞上，才能保证其在宿主肠道内长期发挥作用。在肠道中定植的有益菌起着维持肠道微生态平衡的作用，有利于减少腹泻、炎症的发生，调节机体免疫系统。然而，致病菌也只有在黏附于肠道后，才能在局部产生毒素或者直接侵入到组织内引起宿主不适，致病菌黏附于细胞表面是其入侵人体并感染其致病的第一步，继而引起宿主细胞出现形态结构和生理功能的变化，从而引发疾病症状。细菌细胞黏附定植于宿主肠上皮细胞是长期进化的结果，具有一定特异性。

外源的益生菌能否在肠道黏附和定植是评价益生菌制剂效果的主要指标之一。细菌的黏附性受很多因素的影响，如温度、pH值、菌液浓度等。研究黏附的理论意义在于了解原核生物和真核生物之间初始相互作用，预防致病菌的感染，评价和促进益生菌制剂的益生效果等。

1 黏附机制

细菌的黏附是一个复杂的过程，涉及到许多因素，如菌株的差异、细胞壁表面组成和环境因素。有报道称细菌素对菌株在肠道内的定植及与肠道内其他菌株竞争有优势，而且Bove等也曾从基因表达方面证实这一说法。细菌对细胞的黏附分为两个阶段，可逆的非特异性黏附阶段，以及特异的黏附阶段[6]。一般所指的黏附是细菌的特异性黏附，它是微生物表面黏附素与细菌表面或黏液中特异性受体共同完成，即黏附素-受体学说。

1.1 非特异性黏附机理

细菌的非特异性黏附是一个复杂的物理化学过程，此过程是可逆的，在液体震荡或冲洗中被洗脱，对去污剂很敏感。黏附的强弱主要由菌体表面的疏水性和表面电荷有关。细菌表面的疏水性取决于细菌表面非极性残基的分布，它的强弱决定了细菌的范德华力的大小，细菌表面所带的电荷决定了静电排斥，细菌和黏附对象界面间存在着这两种力。当细菌表面具有较高的疏水性和低静电力，范德华力就会消弱静电荷排斥力，从而细菌和界面发生黏着。

有研究表明，细菌的黏附与细菌的自动聚集及共聚集有关，是许多病原体定植和感染胃肠道的先决条件。益生菌与致病菌的共聚取代致病菌之间的共聚，这种共聚对肠道菌群的异常具有调节作用，这也是益生菌的益生性之一。与致病菌竞争黏附位点、营养源。有研究结果表明，嗜酸乳杆菌M92的黏附能力与其自动聚合能力之间存在相关关系，这可能与细菌表面的蛋白有关。

1.2 特异性黏附机理

在非特异性黏附的基础上，细菌的黏附进入特异性黏附阶段，这阶段主要是细菌表面的黏附素对肠上皮细胞或黏液中的黏附受体进行特异性的结合。黏附素是细菌表面的一类生物大分子，通常为蛋白质或糖蛋白，存在于细胞壁、外膜蛋白、菌毛、鞭毛和微毛等结构中，细菌可通过黏附素附着在宿主细胞上，对细菌定植起着重要的作用。黏附素的种类因菌种不同而异，也随同种的不同菌株而别，通常一种细菌只含一种黏附素，但有些种属细菌或个别菌株能同时表达两种或更多种黏附素。但黏附素的种类因菌种的不同而存在差异，在同种不同菌株之间也存在着差异，一般一种细菌只含一种黏附素，但有些种属细菌或同种的个别细菌能同时表达两种或更多种黏附素。黏附除了具有菌株特异性，宿主也具有特异性，可能与凝集素和糖脂或糖蛋白的相互识别有关。从一种宿主肠道内分离的菌株不一定就能黏附于另一种宿主肠道内，反之亦然。

2 几种益生菌的黏附研究

益生菌的黏附能够保护宿主胃肠道健康，具有抑制病原菌的入侵和感染等重要生理功能，是胃肠道的一道天然屏障，因此黏附是益生菌的一种重要的益生特性。菌株的黏附能力也具有种属特异性，很多的学者对不同菌种的黏附能力和黏附机制进行了研究，包括乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌等。

2.1 乳酸菌

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的通称。大多为厌氧或兼性厌氧菌，广泛地存在于畜、禽肠道，许多食品，物料及少数临床样品中。乳酸菌对宿主肠道的黏附性是其作为益生素的重要指标之一。大量实验表明，黏附性强的乳酸菌被机体摄入后黏附于肠道上皮细胞，黏附性较弱的会随着肠道的蠕动排出体外，表1为不同乳杆菌对不同细胞模型的黏附性。俞涵丽的实验结果表明，嗜酸乳杆菌活菌体和热灭活菌体都能很好地黏附到IPEC-J2细胞上，并且这两种状态的嗜酸乳杆菌能抑制大肠杆菌对IPEC-J2细胞的黏附；刘祥通过研究乳酸杆菌对胃上皮细胞的黏附，结果表明，乳杆菌WR22在活菌和死菌的状态下都能大量黏附于胃上皮细胞，并且能显著降低幽门螺旋杆菌在菌胃上皮细胞的黏附密度；MaréL等利用荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）植物乳杆菌423和唾液乳杆菌241对仔猪肠道的黏附性研究,其结果表明植物乳杆菌423和唾液乳杆菌241能黏附于肠道各个地方，这取决于仔猪的年龄，此外植物乳杆菌素423可能抑制粪肠球菌。乳酸菌是研究较早的益生菌，其在肠道内的成功定植能减少机体受到致病菌的侵扰，维持肠道内微生态的相对稳定，体内实验证明乳酸菌的成功定植能减少仔猪腹泻。

乳杆菌属为无芽孢革兰氏阳性菌，是乳酸菌中种类最多的种群，是目前商业上应用广泛的益生菌菌株。表2为2010年，国家卫生部根据《食品安全法》及其实施条例的有关规定，制定的可用于食品的菌种名单中的可食用的乳杆菌名单。

乳杆菌具有许多益生功能，包括预防腹泻和肠道感染、缓解炎症性肠道疾病、抑制病原菌的生长等。益生性的乳杆菌发挥其益生功能的前提是他们必须在宿主肠道内黏附并成功定植。有研究发现，猪源乳酸杆菌对致病性沙门菌、大肠埃希菌在仔猪小肠上皮细胞上存在竞争性黏附，其应用能减少食物源性污染和提高食品安全。

鼠李糖乳杆菌GG耐胃酸和胆汁的能力优于普通酸奶菌种，实验表明，它能占据细胞表面的位置并分泌黏附素，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等微生物在肠黏膜和细胞上黏附。但活体组织切片证实，鼠李糖乳杆菌GG不论在体外还是在体内均能黏附于肠道上皮细胞，但是定植时间不能长久。因为鼠李糖乳杆菌GG能引起免疫反应，该反应可阻止菌株的永久性定植。

表1 具有黏附性的乳杆菌

表2 可用于食品的乳杆菌属名单

2.2 双歧杆菌

双歧杆菌（Bifidobacterium）是人类和动物肠道天然存在的一类厌氧微生物，主要定居于回肠和结肠，它伴随宿主终生，无毒无害，具有拮抗病原微生物、调节免疫、合成B族维生素及产生抗菌物质等益生性能，能以微生物制剂添加于药品、食品及保健品中。然而，机体内双歧杆菌会随着年龄、饮食、内外环境的改变，以及生病或药物作用等情况下，发生相应的动态变化。双歧杆菌分布在胃肠的数量随年龄的增长而减少，尤其在母乳喂养的婴儿肠道内分布最多。婴儿肠道内的双歧杆菌占总肠道菌的百分之六十，母乳喂养的婴儿粪便中双歧杆菌占粪便微生物总数的98%，而60岁以上老人肠道内的双歧杆菌只占其总肠道菌的7.9%。

双歧杆菌有32个亚型，含有双歧杆菌的生物制剂多达70余种。双歧杆菌是严格的厌氧菌，大量的有机酸不利于它的生长，存活时间短，而且不耐胆汁和胃酸，抗逆性差，为此选育优良的菌株十分重要。荷兰TNO研究所对几百株双歧杆菌做黏附试验，结果只有20%左右的菌可以较好地黏附。表3为不同双歧杆菌对不同细胞模型的黏附性。

表3 具有黏附性的双歧杆菌

2.3 其他

黄正蔚等对致龋菌之一的黏性放线菌（Actinomyces viscosus）进行了研究，发现三七等传统中药能有效抑制黏性放线菌对唾液获得性膜的早期黏附。有研究者发现中药有效成分穿心莲内酯(Andrographolide,AG)可能通过抑制白假丝酵母菌某些黏附基因的表达而抑制其早期黏附。武楠等通过构建的原核表达裁体pQE30/Ace在大肠埃希菌M15中成功地表达，纯化的重组Ace蛋白具有胶原黏附活性，发现Ace蛋白是一种与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)致病性密切相关的表面蛋白，具有良好的黏附活性，有望成为抗肠球菌感染治疗的一个新靶位。对益生菌和致病菌黏附性的研究，有利于更好地控制致病菌对机体的伤害，维持机体健康。有研究者对从粪便中分离到的3株肠球菌进行体外黏附性试验，发现他们的黏附性低，平均在2.3个/细胞。

3 黏附的测定方法

目前测定黏附的方法有多种，各有各的优缺点，根据实验的需要选择合适的方法很重要。黏附实验用到的细胞模型，可根据细菌的来源或其他特性及我们应用需要选择合适的细胞模型或动物模型。

3.1 黏附实验的细胞模型

细菌黏附实验中用到的细胞模型主要有如Caco-2、HT29、IPEC-J2等细胞系，人类肠道细胞系被认为可以代表体内肠道环境，是经常被使用的人类肠道细胞系，经培养后可以形成具有极性的单层细胞，这种单层细胞与小肠上皮组织细胞非常相似。林雪彦等通过比较Caco-2 cell(肠道上皮细胞)、MDCK cell（犬肾细胞）、CEF(鸡胚成纤维细胞)的黏附性，得出结论乳酸杆菌对结肠癌细胞系的黏附性与18日龄SPF鸡胚分离培养的肠上皮细胞黏附性相似，这表明我们可以用结肠癌细胞系代替原代细胞进行益生菌的黏附实验测定。这些细胞系是由肠道癌组织诱导培养得来，与肠道上皮细胞非常相似。但是利用肠道上皮细胞研究黏附性并没有涉及到宿主肠道上皮组织中广泛存在的黏液层的作用。因此，也有人考虑以雏鸡肠黏膜为模型、罗非鱼肠囊模型等。

有些致病菌黏附于宿主细胞后可引起形态结构的变化，例如肠致病性大肠杆菌能使细胞刷状缘绒毛局部变性，胞膜形成杯状结构。而有益的双歧杆菌黏附于细胞后没有发现以上明显变化。

3.2 体外黏附的检测方法

体外黏附的检测方法可分为直接检测法和间接计数法，这些检测法主要针对宿主或者细胞模型中细菌黏附的检测。直接检测法有显微镜计数法和平板计数法。其中，显微镜计数法，是对黏附后细菌进行染色，在显微镜下进行计数，计算每平方毫米或每个细胞黏附的细胞数；而平板计数法常用于细菌对真核细胞或无生物活性表面的黏附检测，对洗脱后的细菌稀释到合适的倍数，固体培养基上涂布培养，最后计算出细菌的数量。这两种方法都不需要特殊的设备，操作简单，但受主观影响较大，重复性欠佳。

间接计数法有放射性同位素、荧光物质、生物素或ELISA抗体标记法等，这些方法相对来说灵敏度精确，减少主观因素的影响，但耗时长、花费高。放射性同位素标记中可以用到的同位素有H3、51Cr、I125及H3，首先对实验菌进行放射性标记，后用液体闪烁仪进行计数。而荧光标记法与同位素法类似，主要指用异硫氰酸荧光素（FITC）对待测菌株进行标记，黏附试验后，对洗脱液中的细菌进行戊二醛固定，然后在荧光显微镜下观察黏附的细菌数。抗体标记法，有人利用Elisa技术测定细菌对细胞的黏附，并且与平板计数法及放射性同位素法进行了比较，实验结果表明，若想提高实验的灵敏度，则需要提高抗体的质量。

此外还有分光光度法，它的原理是利用染料对黏附在细胞或者黏液上的细菌进行染色，然后通过黏附前后吸光值的变化来间接对黏附的细菌进行计数。但这种方法需要细菌数量多，否则达不到分光光度计的检测灵敏度。这种方法操作简单，对实验设备的要求较低，但是研究对象是有黏附力较强的细菌，且灵敏度较低。

3.3 体内黏附的检测方法

体内黏附模型更能真实地反应细菌在宿主肠道内的黏附情况，体外模型中缺少了肠道上皮组织中广泛存在的黏液层的作用。但是受目前试验技术的限制，尚缺乏成熟的细菌体内黏附评价标准。目前，运用普遍的是平板菌落计数法，平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，取确定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。只能对黏附细菌进行粗略的计数，误差较大，无法排除宿主肠道内本身存在的细菌对计数的影响。此外，还可以采用脉冲场电泳计数、荧光原位杂交等技术来检测实验菌株对肠道的黏附性，但这些方法的成本较高且技术含量高。MaréL等利用荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）研究益生菌对仔猪肠道的黏附性,其结果发现益生菌能黏附于肠道的各个部位，这取决于仔猪的年龄，此外植物乳杆菌素423可能抑制粪肠球菌。有研究者将含荧光蛋白基因的质粒倒入到大肠杆菌中，通过检测肠道中其荧光强度来观察大肠杆菌在肠道中的黏附情况，这种方法能实时检测大肠杆菌在肠道中的位置及停留的时间，但是荧光蛋白在机体内稳定性欠佳，所以这种方法并没有得到广泛使用。

4 展望

动物刚出生时，肠道内是无菌的，随着与外界环境接触，迅速形成一个非常多样化的微生物群落。但同时，肠道内的菌群数量会随着年龄的增长而逐渐减少，因而摄入一定量的益生菌，并定植于动物肠道，可有效改善机体健康。我们可以通过添加微生物制剂，增加宿主体内益生菌的含量及种类，增加他们在肠道中的黏附和定植，但前提是有足够数量的活菌摄入。有研究表明，活性乳杆菌的摄入量只有在高于1×106cfu/ml时才能起到益生作用。况且益生菌非常脆弱，容易受到保存环境的影响而失去活性。以双歧杆菌为例，双歧杆菌是人体重要的益生菌，严格厌氧，存活时间短，且不耐胆汁和胃酸，抗逆性差。人体内每天有2.5 L的胃酸和1 L胆盐分泌进入消化道。因此，微生物若想到达肠道且黏附于上皮细胞表面，需有耐受胃酸和胆汁的能力。益生菌经微胶囊包被后，可有效抵御前段胃肠道消化液的消化作用，并在后肠道部分释放出来起益生作用。但目前有关微胶囊包被益生菌在胃肠道内缓释后，在肠道上皮细胞上的黏附和定植尚无研究报道，仍需进一步研究。且由于益生菌菌株的特异性、机体的特异性和益生效应的评估标准不一，益生菌制剂的黏附于定植对肠道致病菌的实际抑制效果仍无法有效评价。因此，建立理想的黏附实验模型和方法对进一步的试验研究具有重要的意义。