同源导入近交系绿色荧光裸小鼠Foxn1nu.B6－CAG－EGFP/SU的建立

研究报告

同源导入近交系绿色荧光裸小鼠Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的建立

沈艳华1，王麒龙2，代兴亮2，陈金2，董军2，兰青2，黄强2

(1. 苏州大学医学部实验动物中心， 江苏 苏州215123；2. 苏州大学附属第二医院神经外科，江苏 苏州215123)

【摘要】目的建立一个能稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)的裸小鼠近交新品系，供包括人脑胶质瘤在内的所有人类肿瘤移植实验用。方法将雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠和雄性Foxn1nu裸小鼠，按同源导入方法进行杂交和回交，用荧光手电筒和匹配的眼镜、多功能活体成像仪、荧光显微镜对是否表达EGFP进行鉴别，传至F10后进行遗传学检测。结果所建品系命名为 Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University)，14个遗传生化位点中13个表型与BALB/c(Foxn1nu)吻合，唯Pep3(肽酶-3)的电泳为b型,而标准的BALB/c近交系为a型;外周血淋巴细胞占全部有核细胞15%，T淋巴细胞仅占0.3%，与亲本的Foxn1nu一致。结论成功地建立了一个既与亲本C57BL/6-TgN(CAG-EGFP)-样稳定表达EGFP，又与Foxn1nu裸小鼠(BALB/c背景)一样具有T细胞缺乏的荧光裸小鼠新品系- Foxn1nu.B6-CAG-EGFP|SU ,Pep3为b型是有别于Foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点。

【关键词】绿色荧光蛋白；转基因小鼠；裸小鼠；近交系

[基金项目]国家自然科学基金(81071766、81172400、81272799、81472739)；国家自然科学基金“胶质瘤干细胞重构微环境诱导宿主细胞癌变的相关机制研究”(81472739)。

[作者简介]沈艳华(1981-)女，助理实验师，硕士，E-mail: shenyanhua@suda.edu.cn。

[通讯作者]黄强，E-mail: hq1936@163.com。

【中图分类号】R332【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.010

Establishment of a new congenic inbred

mouse strain named Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU

SHEN Yan-hua1，WANG Qi-long2，DAI Xing-liang2，CHEN Jin-sheng2，DONG Jun2，LAN Qing2，HUANG Qiang2

( 1. Laboratory animal center of Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123, China；

2. The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123,China)

Abstract【】ObjectiveTo establish a new congenic inbred mouse strain carrying and expressing EGFP and Foxn1nugene for cancer research including human glioma as well. Methods According to criterion of GB14923-2010, the male Foxn1nu nude mice backcross the female C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) transgenic mice for 10 times, Then identify the phenotype using the methods and equipment as below: fluorescent flashlight and matching glasses; multifunction vivo imager; fluorescence microscopy. ResultsThe congenic inbred mouse strain named Foxn1nu. B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University). All the 14 biochemical loci are homozygous and same with Balb/c mouse in addition to the Pep3 loci (“b” type instead of “a” type). Peripheral blood lymphocyte count shows the lymphocytes occupy 15% of nucleated cells; T lymphocytes occupy 0.3%, meet the requirement of inbred strain of EGFP nude mice. ConclusionsEstablished a new congenic inbred strain -Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU which both express EGFP stably, and own immunodeficiency with lack of T lymphocytes. The phenotype “b” of biochemical loci “Pep3” is the unique characteristic that distinguish SU to Foxn1nu.

【Key words】Green fluorescent protein；Transgenic nude mice；Nude mouse；Inbred strain

绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)转基因小鼠(C57BL/6J-EGFP)具备绿色荧光的示踪特性，是肿瘤研究中重要的工具小鼠,我国在2007年才有报告[1]。裸小鼠(Foxn1nu)由于先天性胸腺缺陷、T细胞免疫功能缺乏，是进行人癌异种移植实验的良好宿主[2]。绿色荧光裸小鼠用于肿瘤移植实验，国际上主要见于美国加利福尼亚大学(University of California)的报告,但未明确所用绿色荧光裸小鼠的培育过程。在中国，闫寒等[3]2012年报告，对绿色裸小鼠用人癌移植实验验证其具有表达绿色荧光的同时还有免疫缺陷特征，但未对其遗传性状进行检测，不知是否达到近交系建系标准。张立波等[4]于2013年初步报告了绿色荧光裸小鼠的选育，按 GB/T14927.1-2001检测13个生化位点表明，相关表型与BALB/c小鼠的遗传概貌一致。本研究根据GB/T14927.1-2008对同源导入的第10代小鼠进行了14个生化遗传位点检测,非但达到了建立BALB/c背景的同源导入近交系的建系标准,而且还以Pep3位点是b型而不是a型,有别于亲本Foxn1nu裸小鼠的遗传标志,因而命名为Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University)，现报告如下。

1材料和方法

1．1材料

雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠和雄性Foxn1nu小鼠均购于南京大学模式动物研究所【SCXK(苏)2010-0001】；独立通风笼架(苏州冯氏)；生物安全柜(新加坡ESCO)；小动物多模式活体成像仪(Kodak)；荧光电筒和眼镜(Nightsea)，Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物有限公司)，PCR仪(AB公司)，流式细胞仪(BD公司)，Anti-Mouse CD19 PE-Cyanine7，Anti-Mouse CD3 APC(eBioscience)；小鼠60Co灭菌饲料和垫料购于苏州双狮实验动物饲料科技有限公司(许可证号：苏饲申(2009)05032)。

1.2繁育方法

种鼠饲养于本校实验动物中心小鼠独立送风(IVC)系统内【SYXK(苏)2012-0045】。雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与雄性Foxn1nu小鼠杂交得F1子代均为有毛荧光小鼠，筛选其中的雌性小鼠，待其性成熟(>8周龄)后与亲代雄性Foxn1nu交配(回交)得F2，产生F2子代性状分离，筛选其中雌性有毛荧光鼠与亲代雄性Foxn1nu回交，完成一个回交循环。此回交过程一共进行10代，在F10子代中雌性有毛荧光鼠与雄性荧光裸小鼠杂交，筛选其中荧光亮度高的子代建立血缘扩大群及生产群，作为近交系BALB/c背景荧光裸小鼠供相关实验用。

1.3鉴定

1.3.1表型孕鼠生产后，利用有无鼻毛的特征来辨认新生仔鼠是否为裸小鼠、肛门与生殖器的距离辨别性别、荧光手电筒和眼镜辨别是否发绿色荧光。

1.3.2基因型出生10 d前后剪尾(<0.5 cm)，在56℃热水浴应用蛋白酶K消化6 h，基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，紫外分光光度计测OD值，稀释为100 ng/μL作为DNA模板；PCR反应体系为20 μL，其中PCR mix10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，末次循环后72℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，判读结果。

1.3.3外周血淋巴细胞检测心脏抽血，用流式细胞仪对Anti-Mouse CD19 PE-Cyanine7，Anti-Mouse CD3 APC进行评估。

1.3.4微生物和遗传学检测按GB14922.1-2011、GB14922.2-2011和GB/T14927.1-2008标准分别进行，其中遗传生化位点委托中国食品药品检定研究院完成。

2结果

育成的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠具有如下特性：①检测的14个生化遗传位点基因表型均为纯合，有13个位点与BALB/c小鼠吻合，唯Pep3为b型，有别于Foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点a型(表1)；②外周血常规检测和流式细胞仪分型结果表明，T淋巴细胞明显不足，符合T淋巴细胞缺乏的裸小鼠表型(表2，图1)；③鼠尾组织RT-PCR、荧光手电配合眼镜所见的幼体和成体鼠都能证明其高表达EGFP 和发强烈的绿色荧光(图2,彩插6图3)，两种检测方法的结果对鉴别是否表达EGFP或发绿色荧光是一致的，基于RT-PCR需要剪鼠尾组织，是一种创伤性检测，已被荧光手电检测替代而不作为常规检测方法；④繁殖能力, Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠饲育在IVC内，按SPF级别管理，定期抽哨兵鼠作微生物检测进行监控。平均产仔数6～8只，离乳率100%，子代中裸鼠(Nu+/+)和有毛鼠(Nu+/-)比例基本为1∶1；毛发和外周血红细胞以外的所有器官组织和细胞都发绿色荧光；6～8周龄成鼠体重22～30 g(彩插6图4)。

培育的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠能稳定高表达亲本C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠一样的EGFP，同时又表现为亲本Foxn1nu小鼠所特有的T淋巴细胞严重缺乏特征，适合做人类肿瘤移植的小鼠。

表1　Foxn1 nu.B6- CAG- EGFP/SU生化位点

表2　Foxn1 nu.B6- CAG- EGFP/SU与BALB/c外周血血常规比较

注：Q1为B淋巴细胞群，前者比例为59.1%；后者比例为43.8%；Q4为T淋巴细胞，前者比例仅为0.3%；后者比例为43.2%。 图1　Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU (A,B)与BALB/c(C,D)外周血淋巴细胞分选 Note：Q1：B lymphocytes(Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU 59.1% and BALB/c 43.8%)； Q4：T lymphocytes(Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU 0.3% and BALB/c 43.2%). Fig.1　The comparison of peripheral blood lymphocyte between Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU (A,B) and BALB/c(C,D)

注：M为标志分子量,1号为阴性对照,2-5号为绿色荧光鼠， 上排为EGFP(～200bp)，下排为β-actin。 图2　鼠尾组织EGFP的 RT-PCR电泳图 Note:M:Marker；1: Negative control；2～5: EGFP mice； Upper row: EGFP gene；The lower row: β-actin. Fig.2　The RT-PCR results of mice tissue

3讨论

同源导入近交系是通过杂交、自交和回交的方式形成一个与亲本在一个很小的染色体片段上有所不同的新近交系，要求至少回交10代后的供体品系鼠基因只占受体品系鼠基因组总量的1%以下[5]。本文培育的同源导入近交系Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的供体是C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)，繁育至F10时委托中国食品药品检定研究院随机抽样检测，经检测，国家规定的14个生化位点的表型均为纯合，其中有13个位点的基因表型与BALB/c背景完全一致，也与张立波等在2013年初的报告[4]吻合，然而在Pep3(肽酶-3)位点有b型与a型的区别(表1)。根据建立近交系小鼠的纯合性(homozygosity)，同基因性(isogenicity)和个体性(individuality)要求来衡量这-结果,笔者认为Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU在纯合性方面属于BALB/c来源,在同基因性方面,因Pep3 b型有别于BALB/c的a型，可把这一特征视作Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的特异性基因，并作为一个新品系独特的遗传概貌。这一特征的来源有可能是导入CAG-EGFP基因产生的，由于Pep3所定位的基因位于小鼠1号染色体，新导入的EGFP基因是否也定位于此，有待今后验证。诚然，这-假设还与C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)鼠育种是将EGFP基因导入到第14号染色体相矛盾，是否在本文同源导入时EGFP基因是随机插入到1号染色体上了，也需要进一步研究。

绿色荧光蛋白是从维多利亚发光水母中分离纯化出来的一种能自主催化形成生色团，并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光的蛋白[5]。经过修饰的增强型绿色荧光蛋白具有高度稳定、荧光明亮、对活细胞无伤害等优点，现已成为生物学各领域研究中应用最广泛的分子标记工具之一[6]。自1997年Okabe等[7]采用慢病毒感染构建出β-actin-EGFP转基因小鼠以来，该小鼠在利用胚胎干细胞、骨髓间充质细胞、类胚胎干细胞等进行的细胞移植研究中称其具有“无所不在”的示踪价值[8-10]。随后，进一步研究发现除了心脏和骨骼肌几乎都表达EGFP外，在大多数组织中EGFP “无所不在”的表达模式却并不明显，甚至在不同器官以及同一器官不同细胞之间都是广泛多变的，其中脑就是EGFP阴性表达的器官之一[11-12]。这一不足，本文通过同源近交导入的EGFP基因，在选育过程中依靠荧光手电筒配合眼镜方便地将发绿色荧光最强者纳入育种，经长达3年余的筛选，终于得到包括脑在内的全身各个脏器都表达EGFP的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU，被重点观察的脑在荧光显微镜下，无论是组织还是细胞水平都有EGFP的表达，仅是表达强度有所不同而已,特别要指出的是富集神经干细胞的海马(彩插6图4，6号)和富有造血与免疫系统干祖细胞的骨髓(彩插6图4，7号)都是高表达EGFP细胞的发源地,将为与其相关的示踪研究提供方便，本实验室利用该小鼠已完成了双色荧光示踪的人脑胶质瘤血管来源、肿瘤微环境和间质细胞恶性转化等等系列研究[13-16]。

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〔修回日期〕2014-12-03