HIF－1信号通路在介导DMOG动员MSCs中的作用

研究报告

HIF-1信号通路在介导DMOG动员MSCs中的作用

胡韶君1，余勤1，刘丽珍2，葛婷婷1

(1．浙江中医药大学生命科学学院，杭州310053；

2．浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，杭州310003)

【摘要】目的探讨HIF-1及下游SDF-1α/CXCR4和VEGF/VEGFR 通路在介导DMOG动员MSCs中的作用机制。 方法 将雄性SD大鼠，随机分为五组：生理盐水对照组、DMOG组、YC-1组、AMD3100组、SU5416组。分别采用CFU-F法与流式细胞术检测大鼠骨髓和外周血中MSCs的数量；ELISA法检测骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF蛋白浓度；Western blotting法检测骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达水平。 结果 同NS组比较，DMOG组CFU-Fs 数量显著增加，且CD45-CD90+细胞群比例增加(P < 0.05)；同DMOG组比较，YC-1组、AMD3100组、SU5416组CFU-Fs数量均显著减少，且CD45-CD90+细胞群比例降低(P < 0.05)；同DMOG组比较，YC-1组HIF-1α浓度及蛋白表达显著降低(P < 0.05)，AMD3100组SDF-1α浓度及蛋白表达显著降低(P < 0.05)，SU5416组VEGF浓度及蛋白表达显著降低(P < 0.05)。 结论 DMOG可能通过上调HIF-1α，从而调控其下游SDF-1α/CXCR4通路与VEGF/VEGFR通路诱导MSCs 的动员。

【关键词】间充质干细胞动员；DMOG；缺氧诱导因子-1α；基质细胞衍生因子-lα；血管内皮生长因子

[基金项目]国家自然科学基金(81270566)；教育部高校博士点专项科研基金(20130101120022)。

[作者简介]胡韶君(1989-)，硕士，研究方向：干细胞基础与临床研究。

[通讯作者]余勤(1962-)，教授，博士生导师，研究方向：干细胞基础与临床研究，E-mail: qinyu3587@aliyun.com。

【中图分类号】R332【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.002

Mechanism of HIF-1 signaling pathway in mediating

MSCs mobilization with DMOG

HU Shao-jun1，YU Qin1，LIU Li-zhen2，GE Ting-ting1

(1. College of Life Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;

2. Bone Marrow Transplantation Center, The First Affiliate Hospital, Medical School of Zhejiang University,

Hangzhou 310003, China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the role of HIF-1 and its downstream SDF-1α/CXCR4 and VEGF/VEGFR pathway in mediating MSC mobilization with DMOG. Methods Male SD rats were randomly divided into five groups: Normal saline control group, DMOG group, YC-1 group, AMD3100 group, SU5416 group. We used CFU-F assay and flow cytometry to determine the number of MSCs in rat bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) in each group, respectively. The concentrations of SDF-1α and VEGF both in BM and PB serum in each group were detected by ELISA. Western blotting was used to test protein levels of HIF-1α, SDF-1α and VEGF in BM. ResultsCompared with NS group, the number of CFU-Fs as well as the percentage of CD45-CD90+cells increased in DMOG group (P < 0.05); Compared with DMOG group, the number of CFU-Fs as well as the percentage of CD45-CD90+cells decreased in YC-1 group, AMD3100 group and SU5416 group (P < 0.05). Compared with DMOG group, the concentration and protein expression of HIF-1α decreased significantly in YC-1 group (P < 0.05), the concentration and protein expression of SDF-1α decreased significantly in AMD3100 group (P < 0.05), the concentration and protein expression of VEGF decreased significantly in SU5416 group (P < 0.05). Conclusion DMOG can induce MSCs mobilization possibly via up-regulating the expression of HIF-1α and activating its downstream SDF-1α/CXCR4 and VEGF/VEGFR pathway.

【Key words】Mesenchymal stem cells mobilization；DMOG；Hypoxia inducible factor-1α；Stromalcell-derived factor-lα；Vascular endothelial growth factor

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)动员指应用动员剂或采用动员措施促使骨髓中MSCs释放并迁移到外周血[1]。在组织损伤需要MSCs参与修复的第一时间，给予动员措施，MSCs即可在短时间内从骨髓进入循环池，迁移、归巢入损伤部位，参与损伤修复，此举具有体外细胞移植修复损伤无法比拟的低创性和高效性，因此MSCs动员方法及其机制的研究具有重要的临床意义[1-3]。但是，目前尚缺乏临床可行的MSCs 动员措施，动员机制也不明确。我们前期实验研究发现，脯氨酸羟化酶抑制剂—二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxaloylglycine，DMOG)对小鼠MSCs具有动员作用[4]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor -1α，HIF-1α)是缺氧诱导MSCs动员的关键因子，在MSCs动员过程中起中心作用[5]。HIF-1直接调控的下游信号基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)/CXC族细胞因子受体4(CXCR4)通路与血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFR)通路在干细胞动员与MSCs迁移中起重要作用[6]。

本研究通过给予HIF-1拮抗剂YC-1下调HIF-1的表达，CXCR4拮抗剂AMD3100阻断SDF-1/CXCR4通路，VEGFR拮抗剂SU5416阻断VEFG/VEGFR 通路，探讨HIF-1及下游SDF-1α/CXCR4通路和VEGF/VEGFR通路在DMOG诱导MSCs动员中的作用机制。研究结果将为MSCs动员剂的开发提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验动物

清洁级SD大鼠，4周龄，80±10 g，雄性，来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2008-0016】。实验在浙江中医药大学动物实验中心进行【SYXK(浙)2008-0115】。

1.2主要试剂与仪器

药品及主要试剂：DMOG(Cayman公司)；YC-1、AMD3100、SU5416(Sigma公司)；兔抗大鼠CD45-FITC抗体、兔抗大鼠CD90-PE抗体、荧光同型对照抗体、兔抗大鼠HIF-1α抗体、兔抗大鼠SDF-1α抗体、兔抗大鼠VEGF抗体、兔抗大鼠GAPDH抗体、山羊抗兔二抗(Abcam公司)；DMEM/F12 1∶1培养基(Invitrogen产品)；胎牛血清(FBS，Gibco产品)；红细胞裂解液(北京鼎国生物科技公司)、大鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；分子生物学实验常用试剂(Sigma公司)；SDF-1α、VEGF ELISA检测试剂盒(RayBiotech公司)。

主要仪器：SpectraMax Plus384酶标仪(MD公司)；FC500MCL型流式细胞仪(BectonDiekinson公司)；Mini PROTEAN型垂直电泳槽、1703940 型半干转印槽(Bio-RAD公司)等。

1.3实验分组

雄性SD大鼠随机分为5组：①生理盐水对照组(NS)：给予相同体积的生理盐水；②DMOG组：腹腔注射DMOG 40 mg/kg；③YC-1组：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，YC-1 10 mg/kg；④AMD3100组：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，AMD3100 5 mg/kg；⑤SU5416组：腹腔注射DMOG 40 mg/kg，SU5416 5 mg/kg。每组5只，连续给药7 d。

1.4大鼠骨髓及外周血单个核细胞提取

各处理组连续给药7 d后，无菌条件下取出大鼠股骨和胫骨，剔除肌肉、脂肪等，PBS冲出骨髓单个核细胞(bonemarrow mononuclear cells，BMMNCs)，1000 r/min离心5 min，弃去上清，按1:2加入红细胞裂解液裂解5 min，1000 r/min离心5 min，重悬计数；10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，无菌条件下，10 mL注射器取腹腔动脉血5 mL，缓慢加入含5 mL淋巴细胞分离液的离心管中，2000 r/min离心20 min，吸取白雾层，PBS洗涤2次后，重悬计数外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMNCs)。

1.5大鼠骨髓及外周血中MSCs数量检测

将计数后BMMNCs及PBMNCs以3×106cells/mL重悬于含有20% FBS、1%青-链霉素的DMEM/F12培养基中，接种于25 cm2的塑料培养瓶中，置于37℃、5% CO2培养箱培养。7 d后换新鲜培养基，以后每3 d换液一次，培养14 d后，显微镜下观察计数骨髓CFU-Fs(将呈成纤维样生长，且细胞密度大于50个细胞的集落标记为1个CFU-F)与外周血CFU-Fs。CFU-Fs数量即为骨髓与外周血中MSCs数量。

1.6大鼠骨髓及外周血中CD45-CD90+细胞群比例检测

将1×105个BMMNCs及PBMNCs分别重悬于含100 μL PBS的流式管中，并设置单色及双色同型对照组。每管细胞加2 μL兔抗大鼠 CD45-FITC抗体及5 μL兔抗大鼠CD90-PE抗体。室温避光条件孵育30 min后，PBS洗去未结合抗体，流式细胞仪检测CD45-CD90+细胞群比例。

1.7骨髓上清及外周血清中SDF-1α、VEGF浓度检测

各处理组连续给药7 d后，无菌条件下取各组大鼠外周血、股骨及胫骨，方法如1.4。PBS冲出BMMNCs，4℃，1000 r/min离心10 min，收集骨髓上清；取各组大鼠外周血5 mL，4℃，1000 r/min离心20 min，收集外周血血清，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)检测SDF-1α、VEGF浓度，具体过程按照试剂盒说明书操作。

1.8HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达检测

取各组大鼠BMMNCs，方法如1.4。收集各组大鼠BMMNCs至1.5 mL EP管中，加200 μL预冷的细胞裂解液裂解样本5 min，充分裂解后，4℃，12000 r/min离心20 min，保留上清。马斯蓝染色法测定各组蛋白总量，将各组蛋白浓度稀释至5 μg/μL。SDS-PAGE电泳，半干法转膜，封闭2 h，分别加兔抗大鼠HIF-1α抗体、兔抗大鼠SDF-1α抗体、兔抗大鼠VEGF抗体、兔抗大鼠GAPDH抗体(HIF-1α稀释度1∶1000，SDF-1α稀释度1∶1000，VEGF稀释度1∶1000，GAPDH稀释度1∶2000，4℃孵育过夜，洗膜液漂洗3次，加山羊抗兔二抗(稀释度1∶2000)室温孵育1 h，洗膜液漂洗3次，ECL显影，待胶片出现清晰的蛋白条带，拍照，用Image J软件进行吸光度分析，测出各组样本蛋白相对表达水平。

1.9统计学处理

2结果

2.1CFU-F法与流式细胞术检测大鼠骨髓及外周血中MSCs数量

CFU-F法结果显示：DMOG组大鼠骨髓及外周血CFU-Fs数量较NS组显著增加(13.4±1.14VS 9.2±0.83；2.6±0.54VS 1.4±0.54，P< 0.05)。YC-1、AMD3100、SU5416组骨髓CFU-Fs数量较DMOG组显著降低(9.8±0.83、10.4±1.14、9.6±1.14 VS 13.4±1.14，P< 0.05)，同时外周血CFU-Fs 数量也显著降低(1.2±0.83、1.6±0.54、1.6±0.54 VS 2.6±0.54，P< 0.05)(表1)。

表1　骨髓及外周血中CFU-Fs数量

注：与NS组比较，#P< 0.05；与DMOG组比较，*P<0.05。

Note: Compared with NS group,#P<0.05; compared with DMOG group,*P<0.05.

流式细胞术结果显示：DMOG组骨髓与外周血中CD45-CD90+细胞群比例与NS组比较明显升高(3.67±0.17% VS 2.94±0.06%，15.3±0.33% VS 6.37±0.23%，P< 0.05)。YC-1、AMD3100、SU5416组骨髓与外周血中CD45-CD90+细胞群比例与DMOG组比较显著降低(2.52±0.05%、2.55±0.10%、2.48±0.07% VS 3.67±0.17%；12.6±0.31%、13.1±0.55%、11.6±0.53% VS 15.3±0.33%，P< 0.05)(彩插2图1)。

2.2ELISA检测大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α，VEGF 浓度

ELISA检测结果显示：DMOG组处理7 d后，大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α、VEGF浓度与NS组相比显著升高(P< 0.05)。AMD3100处理组大鼠骨髓上清及外周血清中SDF-1α浓度同DMOG相比显著降低(P< 0.05)。SU5416处理组大鼠骨髓上清及外周血清中VEGF浓度同DMOG相比显著降低(P< 0.05)(图2)。

注：A，骨髓上清SDF-1α浓度；B，骨髓上清中VEGF浓度；C，外周血清中SDF-1α浓度； D，外周血清中VEGF浓度。与NS组比较， *P<0.05。与DMOG组比较， #P<0.05。 图2　骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF浓度 Note：A, SDF-1α concentration in BM serum；B, VEGF concentration in BM serum；C, SDF-1α concentration in PB serum； D, VEGF concentration in PM serum. Compared with NS group， *P<0.05. Compared with DMOG group， #P<0.05. Fig.2　Quantification of SDF-1αand VEGF concentrations in BM and PB

2.3Western blotting法检测大鼠骨髓细胞中HIF-1α，SDF-1α，VEGF的表达

Western blotting结果显示，HIF-1α、SDF-1α、VEGF 表达在给予DMOG后明显增加(P< 0.05)。 YC-1组HIF-1α表达较DMOG组明显降低(P< 0.05)。AMD3100组SDF-1α表达较DMOG组明显降低(P< 0.05)。SU5416组VEGF表达较DMOG组显著降低(图3)。

注：A，各组大鼠骨髓细胞HIF-1α、SDF-1α、VEGF的表达水平；B、C、D：分别为HIF-1α、SDF-1α、 VEGF相对表达定量结果。与NS组比较， *P < 0.05。与DMOG 组比较， #P < 0.05。 图3　骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达水平 Note：A:The expression level of HIF-1α, SDF-1α and VEGF in BM cells; B, C, D：Relative levels of HIF-1α, SDF-1α and VEGF proteins were presented as the fold increase normalized to NS. Compared with NS group, *P < 0.05. Compared with DMOG group, #P < 0.05. Fig.3　The protein expression of HIF-1α, SDF-1α and VEGF

3讨论

MSCs动员方法及其机制的研究具有重要的临床意义。我们前期研究发现脯氨酸羟化酶抑制剂—DMOG对小鼠MSCs具有动员作用[4]，然而其潜在机制尚不十分明确。研究发现，脯氨酸羟化酶在HIF-1的调控中有至关重要的作用，因而被认为是体内的氧感受器[7]。HIF-1α是脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase, PHD)唯一的底物。脯氨酸羟化酶抑制剂(PHD inhibitor，PHI)通过抑制PHD的活性，而抑制HIF-1α的羟化，减少常氧状态下HIF-1α的降解，从而稳定HIF-1α的表达，上调HIF-1信号通路。DMOG为酮戊二酸类似物，通过与内源性的2-酮戊二酸竞争从而抑制脯氨酸羟化酶，是当前脯氨酸羟化酶抑制剂研究的热点[8-9]。在本研究中，我们采用CFU-F法和流式细胞术定量检测骨髓及外周血中MSCs的数量，结果显示DMOG组骨髓与外周血MSCs数量较NS组显著增加，CD45-CD90+细胞群比例与NS组比明显升高，验证了DMOG对MSCs的动员作用。

HIF-1由HIF-1α及HIF-1β两个亚基构成，HIF-1β为HIF-1的构成性亚基，在细胞浆中稳定表达；HIF-1α为HIF-1的调节性亚基。YC-1作为靶向HIF-1α抑制剂，可以有效抑制动物体内HIF-1α的表达[10-12]。本研究结果发现，YC-1可以明显抑制HIF-1α上调。抑制HIF-1通路后，YC-1组的MSCs动员效率明显降低，且SDF-1α浓度及蛋白表达显著降低，表明HIF-1α在DMOG诱导的MSCs动员中起重要作用。研究证实，SDF-1α在内皮细胞受转录因子HIF-1直接调控。CXCR4是目前所知的SDF-1α的唯一受体。同时国内外研究与我们前期研究均发现SDF-1α/CXCR4通路在MSCs迁移中发挥重要作用[5]。AMD3100是SDF-1α受体CXCR4的阻断剂，能竞争性地结合CXCR4，有效阻断SDF-1α/CXCR4通路。我们研究结果发现，阻断SDF-1α/CXCR4通路后，AMD3100组MSCs动员效率明显降低，且SDF-1α浓度及蛋白表达显著降低。VEGF/VEGFR是介导骨髓微环境改变、促进MSCs迁移的重要通路。VEGF是受HIF-1直接调控的细胞生长因子，可通过与其特异性受体VEGFR结合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性[13]。SU5416是一种脂溶性小分子合成受体酪氨酸激酶抑制剂[14-15]，它通过与酪氨酸激酶受体内激酶结构域结合竞争性抑制ATP而发挥作用。本研究通过SU5416特异性阻断VEGF/VEGFR通路，结果发现MSCs动员效率降低，且VEGF浓度及蛋白表达降低。既往研究证实，VEGF/VEGFR与SDF-1α/CXCR4通路存在一定的交互作用，VEGF可上调胶质瘤细胞与血管内皮细胞中SDF-1α及其受体CXCR4的表达，但并不影响SDF-1α向细胞外分泌[16-17]。本研究结果提示，SU5416抑制骨髓细胞VEGF表达的同时对SDF-1α蛋白表达也有一定的抑制作用，但骨髓上清中分泌型SDF-1α水平并没有显著变化。VEGF与SDF-1通路之间相互作用的具体机制还需进一步研究。

综上所述，DMOG诱导MSCs动员可能的作用机制为：机体接受DMOG后，抑制HIF-1α的羟化，HIF-1信号上调，调控其下游基因SDF-1α、VEGF 表达增加，故DMOG可能通过上调HIF-1，从而调控其下游SDF-1α/CXCR4通路与VEGF/VEGFR 通路诱导MSCs 动员。

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〔修回日期〕2014-10-09