乙肝病毒X蛋白等增强肝癌细胞NF—KB转录活性的实验

林佳华

【摘要】目的：研究分析乙肝病毒X蛋白结合蛋白（英简HBXIP）对肝癌细胞核因子（英简NF-KB）转录活性的影响。方法：应用基因共转染把NF-KB报告基因质粒HBXIP、pNF-KB-Luc真核表达载体（即为pcDNA3-hbxip）导入人肝癌细胞（H7402）系内，通过荧光素酶活性进行分析。结果：肝癌H7402细胞过表达HBXIP以后，明显提高了NF-KB转录活性；肝癌H7402细胞内HBXIP过表达以后，p65/NF-KB在细胞核内的含量显著增多。结论：乙肝病毒X蛋白结合蛋白能提高细胞核中p6 5/NK-KB蛋白的含量，具有良好的转录调控作用，以利于细胞增殖。

【关键词】乙肝病毒X蛋白结合蛋白；肝癌细胞

乙肝病毒X蛋白结合蛋白是具有十分重要的生物活性的一种组成型蛋白质，其由91个氨基酸构成。以往研究发现，HBXIP能够与HBX（乙肝病毒X蛋白）的C端发生特异性结合，进而减小HBX的活性，同时使HBX病毒复制周期发生改变。HBXIP既可以对HBX蛋白诱导细胞凋亡的途径进行抑制，并且还能调节细胞周期而增加细胞增殖。为了深入了解HBXIP增加细胞增殖的作用机制，针对HBXIP蛋白对NFKB转录活性的影响进行了进一步探究，具体如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

真核表达载体pEGFP-c2、pcDNA3均保存在本室；NF-KB荧光素梅报告基因质粒（即为pNF-KB-Luc）由Promega公司提供；人肝癌细胞系H7402源于市医院。

1.2方法

将真核表达载体与报告基因质粒一同转染导入H74002细胞内，待转染40小时后，根据照荧光素酶试剂盒的说明书指示，溶入适量的裂解缓冲液，在常温下反应15分钟，然后将细胞裂解的产物刮下，再转移至1.5ml规格的离心管内，离心速为14000r/min，离心时间15秒。将上清液置于另一个同样规格的离心管内。每隔离心管内含有荧光素酶测定缓冲液，剂量为100μl，并加入100μl的细胞裂解液，即刻混匀。应用荧光光度计检测10秒钟，光输出后再加入荧光淬灭剂，剂量为100u1，强萤火虫荧光素酶彻底淬灭，然后开始海肾荧光素酶反应，计算10秒后的光输出值。

应用PBS对细胞进行重复洗涤2次，然后缓慢注入裂解液A，剂量为400μ1。冰浴10分钟，然后再加入NP-40，剂量为16μ1，混合均匀，10秒钟后继续冰浴，时间为10分钟。在4摄氏度环境下，离心2分钟，离心速度为12000r/min。如果有沉淀，则继续加入裂解液A，剂量为500μ1，再次洗涤，然后4摄氏度环境离心，时间为2分钟，舍弃上清液。沉淀加入事先预冷的裂解液B，冰浴处理，时间为20分钟，然后4摄氏度环境进行离心，时间为12分钟，离心速度为14000r/min。对上清液进行定量分析，同时实施免疫印迹实验检查。

通过预冷的PBS对细胞进行2次洗涤，再加入细胞裂解液，置于冰上，时间为20分钟。在4摄氏度环境下进行离心处理，时间为20分钟，离心速度为12000r/min，取上清液进行定量分析。取35g左右的总蛋白实施12%SDS-PAGE实验，通过电转移到硝酸纤维素膜上，用5.0%浓度的脱脂奶粉进行封闭，时间为1小时。然后，加入一抗，置于室温孵育，时间为2-3小时，应用PBST洗膜。分别加入抗兔IgG、抗鼠IgG在室温下孵育一个小时，再用PBST洗膜，应用增强型ECT试剂盒，放置在暗室进行曝光显影。

2、结果

通过双荧光检测仪实验发现，HBXIP基因过表达可以明显提高NF-KB转录活性；提取核蛋白后，通过免疫印迹检查，HBXIP过表达以后，细胞核内p65/NF-KB的含量有所改变。瞬时转染HBXIP基因后，能够显著提高H7402细胞核内p65/NF-KB的水平。

3、讨论

NF-KB是人体细胞中十分重要的一种核转录因子，以调控多种基因的表达实现细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生、免疫反应的参与。当细胞处于静息状态时，NF-KB通过无活性的状态存活在细胞质内，并与特定的KB序列相结合，同时能够集合协同因子起到调控转录的作用。通过荧光素酶报告检查发现，HBXIP过表达能够增强NF-KB转录活性。通过提取H7402细胞内的核蛋白，进行免疫印迹实验观察，细胞核中的p65/NF-KB水平显著升高。由此推断，乙肝病毒X蛋白结合蛋白能提高细胞核中p65/NK-KB蛋白的含量，具有良好的转录调控作用，以利于细胞增殖。