抗体重链轻链可变区连接条件的优化

胡化静，谭树华

(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏 南京210009)

抗体重链轻链可变区连接条件的优化

胡化静，谭树华

(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏 南京210009)

摘要：采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法拼接VH、Linker、VL，优化了SOE-PCR中模板量、引物量、退火温度及DNA聚合酶量。确定了优化的连接条件为：50 μL反应体系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，于64.8 ℃退火，7个循环后，各加入上下游引物1.5 μL(10 μmol·L-1)，再另加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，于62.0 ℃退火，扩增25个循环。在改进后的连接条件下，可获得高纯度、高丰度的扩增产物，利于抗体库的多样性。

关键词：单链抗体；重叠延伸PCR；优化

相对于繁琐的杂交瘤技术，噬菌体抗体库技术是获得基因工程抗体的一个有里程碑意义的方法。通过模拟天然抗体库，可获得高特异性抗体[1-2]。库容量大、多样性好的抗体库是筛选出有应用价值抗体的前提。抗体库的多样性主要受引物及PCR(SOE-PCR)影响[3]。作者在此对重叠延伸PCR条件进行了优化，保证VH和VL的随机拼接，增加抗体库多样性。

1实验

1.1　材料与仪器

SfiI-VH-Linker-、Linker+-VL-NotI片段由本实验室制备并保存；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(with GC Buffer)、DL1000 DNA Marker、Agarose，TaKaRa公司。

高速离心机、PCR仪，Eppendorf公司；Nanodrop 2000型分光光度计，Thermo Scientific公司；凝胶成像仪、HE-90型小号水平电泳槽、EPS-300型电泳仪，上海天能科技有限公司。

1.2　引物设计

引物：SfiI 5′-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3′及NotI 5′-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3　模板量的优化

使用分光光度计测得SfiI-VH-Linker-、Linker+-VL-NotI模板的浓度，按两者物质的量比为1∶1配制PCR扩增体系。50μL反应体系中SfiI-VH-Linker-含量分别为58 ng、116 ng、232 ng、350 ng，对应的Linker+-VL-NotI含量分别为50 ng、100 ng、200 ng、300 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水补足至46.5μL，混匀，4 ℃瞬时离心。以较低退火温度进行PCR。

1.4　引物量的优化

配制50μL反应体系，其中引物(10μmol·L-1)量分别为1.0μL、1.5μL、2.0μL，模板量采用优化后的结果，以较低退火温度进行PCR。

1.5　退火温度的优化

在优化好模板量及引物量的基础上，优化退火温度。首先将第一步退火温度设定为49~68 ℃，第二步退火温度设定为65 ℃。在优化好第一步退火温度的基础上，设定第二步退火温度为50~71 ℃。在优化好第二步退火温度的基础上，重新优化第一步退火温度。

1.6　DNA聚合酶量的优化

在优化的模板量、引物量及退火温度下进行PCR，第二步扩增分别做另加DNA聚合酶和不加DNA聚合酶的对比实验。

2结果与讨论

2.1　模板量的优化(图1)

M.DL1000 DNA Marker　1~4.SfiI-VH-Linker-分别为58 ng、116 ng、232 ng、350 ng，对应的Linker+-VL-NotI分别为50 ng、100 ng、200 ng、300 ng

由于Linker部分GC含量很高，普通的DNA聚合酶不能有效扩增出VH-Linker-VL融合基因，常出现弥散及错配[4]，而PrimeSTAR HS DNA Polymerase(with GC Buffer)则完全满足要求[5]。为了保证最大限度利用VH和VL，两者的物质的量比以1∶1最佳。由图1可知，随着模板量的增加，条带越来越亮，50μL反应体系中，当SfiI-VH-Linker-为232 ng、Linker+-VL-NotI为200 ng时，条带最佳；模板量再提高时，条带亮度几乎不增加，条带弥散，与文献[6]报道一致。因此，确定优化的模板量SfiI-VH-Linker-为232 ng、Linker+-VL-NotI为200 ng。

2.2　引物量的优化(图2)

M.DL1000 DNA Marker　1~3.引物量分别为1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL

由图2可知，在50μL反应体系中，上下游引物各加1.5μL时条带较纯，引物量达到2.0μL时条带稍微弥散。因此，确定优化的上下游引物量为1.5μL。

2.3　退火温度的优化(图3)

退火温度过低易出现非特异性扩增，退火温度过高产物量低，因此，无论是第一步扩增还是第二步扩增都需在合适的退火温度下进行。由图3可知，设定第一步退火温度为49~68 ℃，第二步退火温度为65.0 ℃，当第一步退火温度为56.7 ℃时，条带最亮(图3a)。设定第一步退火温度56.7 ℃，第二步退火温度为50~71 ℃，当第二步退火温度为62.0 ℃时，条带最亮(图3b)。继续设定第一步退火温度为49~68 ℃，第二步退火温度为62.0 ℃，当第一步的退火温度为64.8 ℃时，条带最亮(图3c)。因此，确定优化的第一步退火温度为64.8 ℃，第二步退火温度为62.0 ℃。

M.DL1000 DNA Marker1~8.退火温度，℃：49.0、51.9、54.0、56.7、59.8、62.7、64.8、68.01′~8′.退火温度，℃：50.0、53.2、55.5、58.5、62.0、65.1、67.4、69.4a.第一步退火温度设定为49~68 ℃，第二步退火温度设定为65.0 ℃b.第一步退火温度设定为56.7 ℃，第二步退火温度设定为50~71 ℃c.第一步退火温度设定为49~68 ℃，第二步退火温度设定为62.0 ℃图3　退火温度的优化Fig.3　Optimization of annealing temperature

2.4　DNA聚合酶量的优化(图4)

M.DL1000 DNA Marker　1.第二步扩增不加酶2.第二步扩增加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL

本实验中，第一步不加引物扩增7轮，如果第二步扩增加引物的同时再加DNA聚合酶，可以大大提高产物量，可能因为前7轮扩增已导致酶活性降低。由图4可知，在50μL反应体系中，在第二步扩增加0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase后，条带比不加DNA聚合酶亮。

综上，确定最佳的连接条件为：50μL反应体系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水补足至46.5μL，混匀，4 ℃瞬时离心。第一步扩增条件：98 ℃ 10 s，64.8 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min，7个循环。加入引物SfiI 1.5μL，引物NotI 1.5μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，进行第二步扩增：98 ℃ 10 s，62.0 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，25个循环。

3结论

采用重叠延伸RCR(SOE-PCR)法拼接VH、Linker、VL，优化了SOE-PCR中模板量、引物量、退火温度及DNA聚合酶量。确定了优化的连接条件为：50μL反应体系中，SfiI-VH-Linker-232 ng，Linker+-VL-NotI 200 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each)4.0μL，2×PrimeSTAR GC Buffer 25μL，水补足至46.5μL，混匀，4 ℃瞬时离心。于64.8 ℃退火，7个循环后，各加入上下游引物1.5μL(10μmol·L-1)，再另加PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL ，于62.0 ℃退火，扩增25个循环。在改进后的连接条件下可获得高纯度、高丰度的扩增产物，利于抗体库的多样性。

运用此法可以保证VH和VL的随机拼接，SfiI-VH-Linker-VL-NotI纯度高，抗体库多样性好，同时也为其它高GC的SOE-PCR条件优化提供参考。

参考文献：

[1]HAMZEH-MIVEHROUD M,ALIZADEH A A,MORRIS M B,et al.Phage display as a technology delivering on the promise of peptide drug discovery[J].Drug Discovery Today,2013,18(23):1144-1157.

[2]KUGLER J,ZANTOW J,MEYER T,et al.Oligopeptide m13 phage display in pathogen research[J].Viruses,2013,5(10):2531-2545.

[3]张聪敏,霍萍萍,赵宝华.噬菌体抗体库构建技术在疾病防治中的应用[J].生物技术通报,2011,(10):84-89.

[4]REDDY P K,RAMLAL S,SRIPATHY M H,et al.A simple and universal ligation mediated fusion of genes based on hetero-staggered PCR for generating immunodominant chimeric proteins[J].Gene,2012,509(1):104-109.

[5]CHERRY J,NIEUWENHUIJSEN B W,KAFTAN E J,et al.A modified method for PCR-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2008,70(6):820-822.

[6]孟祥平,杨建英,乔晓岚,等.优化重叠延伸PCR条件构建BTRCP-CypA融合基因[J].生物技术,2013,23(6):51-54.

Optimization of Ligation Conditions of Antibody Fragment VH and VL

HU Hua-jing,TAN Shu-hua

(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：Splicing overlap extension PCR(SOE-PCR) was used to connect the fragments of VH,Linker and VL.The templates amount,primers amount,annealing temperature and DNA polymerase amount in SOE-PCR system were optimized.Results showed that,in 50 μL PCR system,232 ng SfiI-VH-Linker-and 200 ng Linker+-VL-NotI annealed at 64.8 ℃ for 7 cycles,after adding 1.5 μL primers and 0.5 μL DNA polymerase,25 cycles were amplified at the annealing temperature of 62.0 ℃.A high purity and abundant product that was beneficial to the diversity of the antibody library could be obtained by the modified ligation conditions.

Keywords：single chain antibody;splicing overlap extension PCR(SOE-PCR);optimization

中图分类号：Q 784

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)05-0055-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.014

收稿日期：2015-01-16

作者简介：胡化静(1989-)，女，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向：基因工程药物，E-mail：huhuajing0124@126.com；通讯作者：谭树华，教授，博士生导师。