油茶岑软系列优良无性系的ISSR分子鉴别及遗传分析

刘 凯，张乃燕，王东雪，江泽鹏，曾雯珺

（广西壮族自治区林业科学研究院，广西油茶良种与栽培工程技术研究中心，广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002）

油茶岑软系列优良无性系的ISSR分子鉴别及遗传分析

刘 凯，张乃燕，王东雪，江泽鹏，曾雯珺

（广西壮族自治区林业科学研究院，广西油茶良种与栽培工程技术研究中心，广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002）

为了解决油茶良种生产上种苗品种混乱的问题，本研究采用ISSR分子标记技术，对广西岑溪软枝油茶10个优良无性系进行分子鉴别及遗传分析，结果表明：筛选出10条多态性高、条带清晰、稳定性好的引物，共扩增得到108条条带，81条为多态性条带，多态性比率占75%；根据引物扩增的ISSR图谱条带，建立了10个‘岑软系列’无性系的ISSR鉴定识别卡，其中3条引物可独立对区分所有供试品种；聚类分析表明，岑软系列无性系间遗传距离为0.083～0.448之间，在遗传距离为0.411处可较明显将10份供试材料可分为2类。

油茶；无性系；简单序列重区间；指纹图谱

油茶Camellia oleifera是我国南方重要的木本油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料植物[1-2]。茶油中富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，含量一般在90%以上，其营养价值和保健价值可与橄榄油相媲美，是名副其实的优质食用植物油[3-4]。岑溪软枝油茶是我国第一个选育出来的油茶良种，属普通油茶的一个农家品种，以枝条韧软、挂果下垂而得名，兼备了早实、高产、稳产等优良经济性状，在此基础上先后筛选并通过良种审、认定的多个高产优良无性系，适宜我国南方及东南亚地区栽培良种[5-6]。

传统的油茶品种鉴别多以形态特征、生物学特征、经济性状为主要依据，但这些指标的评价有时很细微，部分差异仅体现在特定发育阶段（如花期、果期）、特定经济性状（如出籽率、出油率、油品质）等，易受到环境因素的影响，且外观表现的数量有限，特别在苗期不具备多数识别特征，单纯依靠经验区分难度极大，导致目前市场油茶岑软系列优良无性系品种混乱、以劣充优、以实生苗充当无性系的现象常有发生，严重制约了油茶良种化的进程[7-8]。究其原因，关键问题是缺乏一种快捷、准确适合于油茶品种早期鉴别的技术方法。

简单序列重复区间扩增（inter-simple sequence repeats,ISSR)是一种利用DNA序列中简单重复区域片段长短不一、位点变异丰富的原理发展起来的分子标记技术，且为显性标记[9]。它在无需预先获知序列的信息前提下，利用锚定的简单重复序列为单一引物，直接在分子水平上反映出遗传差异。ISSR标记具有实验成本低，操作简单，快速灵敏，所需DNA模板量少，多态性丰富等优点，已在植物种质资源遗传多样性、亲缘关系分析、品种鉴定、遗传作图、基因定位等方面得以运用[9-10]。本研究采用ISSR标记技术，对岑溪软枝油茶10个不同的优良无性系进行鉴别，探索分子鉴别技术体系，有效的筛选与主要经济性状相关的基因片段，为下一步杂交选配亲本、配置杂交组合，并进行杂种优势的早期鉴定与筛选，创制集高产、优质、高抗的优良综合性状的油茶新品系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料10个岑软优良无性系均取自于岑溪国家油茶良种繁育基地种子园，分别采集新鲜嫩叶，放有变色硅胶的密封袋中干燥后，置于实验室-70℃冷冻保存备用（见表1）。

表1 10个油茶无性系供试材料Table 1 Tested materials of 10 Camellia oleifera superior clones

1.2 DNA的提取

采用参考文献[11]中改良CTAB法提取油茶基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检查每个样品质量，用核酸蛋白分析仪（DU640)测定其浓度和纯度。

1.3 ISSR扩增及产物检验

参照参考文献[12]确定油茶ISSR-PCR最佳反应体系，随机选三个不同共试材料DNA模板，从ISSR引物筛选出条带清晰、多态性高的为实验引物。采用20 µLPCR反应体系：模板DNA为50 ng，dNTPs浓度为 0.20 mmol/L，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，引物浓度为0.7 μmol/L，TaqDNA聚合酶为2.2 U。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变形30 s，退火温度退火45 s，72℃延伸90 s，共计36个循环；72℃总延伸7min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像检测结果。

1.4 数据统计及分析

ISSR为显性标记，将同一引物所得的电泳图谱中的每个条带视为一个位点，选用条带清晰、重复性好用于分析，按照凝胶同一位置上条带的有或无赋值，有带记为‘1’，无带记为‘0’，建立ISSR鉴定识别卡。统计每条引物扩增出的总带数和其中的多态性带数，计算多态位点百分率（PPB）。利用聚类分析软件（PopGen32）进行谱带统计处理，按照UPGMA法进行聚类分析，得到亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 引物筛选与多态性分析

本次实验从ISSR引物中筛选出多态性高、条带清晰、稳定性好的10条引物，对10个岑软优良无性系的模板DNA进行PCR扩增与检测，建立了10份供试材料的ISSR指纹图谱，经统计共检测出108条条带，扩增片段大小在150～2 000 bp之间，每条引物扩增条带数为8～13条不等，其中81条为多态性条带，比列占75%（见表2）。UBC895、UBC825引物电泳结果见图1和图2。可见，同一引物不同品种的图谱不同，不同引物相同品种的图谱也不同，这充分体现了不同供试材料在DNA水平上的遗传差异性。

2.2 无性系的分子鉴别

根据引物扩增的ISSR图谱条带有或无赋值，建立了10个‘岑软系列’无性系的ISSR鉴定识别卡（见表3），基于分离特异条带位点的有无、多少及不同引物扩增谱带类型组合，可有效地对10个‘岑软系列’无性系品种进行分子鉴别。引物U895、U844电泳图见图1和图2。引物U895、U844、U855均可单独对10个‘岑软系列’无性系进行区分，其它引物两两组合可区分10个‘岑软系列’无性系。

表2 引物扩增带数及多态性性比较Table 2 Number of primers amplificaion and comparisons of polymorphism

图2 引物844对10个油茶无性系ISSR-PCR扩增结果Fig.2 ISSR-PCR patterns of 10 Camellia oleifera clones ampli ficaion by primer UBC844

表3 引物U895建立的10个‘岑软’无性系的ISSR鉴定识别卡Table 3 Recognition card based on ISSR from 10 clones of ‘Cenruan’(primer U895)

2.3 聚类分析

利用聚类分析软件（PopGen32）进行谱带统计处理，按照UPGMA法进行聚类分析绘出10个油茶无性系的遗传亲缘关系树状图（见图3）。10个油茶无性系供试材料的等位基因平均数Na为1.350 9，有效等位基因Ne为1.115 0，基因多样性指数即平均期望杂合度He为0.201 8，Shannon信息指数I为0.304 3，说明‘岑软系列’无性系遗传变异较小，这也充分说明岑溪软枝油茶在种内水平上具有一定的稳定性。把供试材料基因型间的遗传距离大小作为聚类的依据，结果显示，其遗传距离在0.083～0.448之间，在遗传距离为0.411处可较明显将10份供试材料可分为2类：岑软3号、岑软4号、岑软25号、岑软14号、岑软24号、岑软22号、岑软26号为第Ⅰ类；岑软2号、岑软11号、岑软23号为第Ⅱ类。

图3 10个油茶无性系ISSR聚类分析Fig.3 Cluster analysis for 10 Camellia oleifera clones by ISSR

3 讨 论

本实验采用ISSR分子标记技术，以筛选出多态性高、条带清晰、稳定性好的10条ISSR引物，对油茶‘岑软系列’10个高产无性系进行ISSR标记分析，共检测出108条条带，其中81条为多态性条带，比列占75%，充分体现了供试材料在DNA水平上的遗传差异性。利用引物扩增的ISSR图谱条带有或无赋值，绘制了10个‘岑软系列’无性系的ISSR鉴定识别卡，初步建立了分子鉴别体系。聚类分析表明：其遗传距离在0.083～0.448之间，在遗传距离为0.411处可较明显将10份供试材料可分为2类： 岑软3号、岑软4号、岑软25号、岑软14号、岑软24号、岑软22号、岑软26号为第Ⅰ类；岑软2号、岑软11号、岑软23号为第Ⅱ类。由于本实验采用ISSR标记引物数量偏少，加之实验材料未能完全覆盖，可能会对实验结果造成一定的影响，所以仍需更多数量标记条带、更全面的实验材料进行进一步研究考证。

本研究采用Touch Down PCR对供试材料模板进行ISSR-PCR扩增，Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1℃或者是0.5℃反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。Touchdown PCR是不仅可以增加反应的特异性，降低非特异条带的产生，而且只用一次PCR就可以确定最适Ta值，避免了对引物进行最佳复性温度的优化与测定工作，大大减少工作量。

目前，油茶科研一直以常规育种为中心开展，在抗旱抗涝等胁迫[13]、高光效品系[14]及组培扩繁体系建立[15]等方面也做了大量工作[16]。随着分子生物学在油茶科研上的研究应用，分子标记技术为油茶优良无性系的鉴别提供了一种快速、可靠的鉴定方法。谭晓风[17]等利用RAPD标记对山茶属金花茶组及油茶组植物进行了亲缘关系的聚类分析；王保明[18]、温强[19]、彭邵锋[20]等分别对不同地区油茶优良无性系进行了分子鉴别。

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Identi fication and genetic analysis ofCamellia oleifera‘Cenruan’ series superior clones by ISSR molecular marker

LIU Kai, ZHANG Nai-yan, WANG Dong-xue, JIANG Ze-peng, ZENG Wen-jun
(Guangxi Academy of Forestry, Improved Variety and Cultivation Engineering Research, Center of Oil-Tea Camellia in Guangxi,Nanning 530002, Guangxi, China)

In order to solve the problem of seedling varieties confused onCamellia oleiferasuperior clones production, ISSR was used to identi fied and genetic analysis ofCamellia oleifera‘Cenruan’ series superior clones, 10 primers were screened out and 108 countable bands were ampli fied from clones, of which 81 have polymorphism, and the percentage of polymorphic bands is 75%;Based on ISSR map which was used to establish the recognition card from 10 clones of ‘Cenruan’, there were 3 primer which could identify all tested clones respectively. The genetic distance(GD) was from 0.083 to 0.448 of ‘Cenruan’ series superior clones and the 10‘Cenruan’ series superior clones could be divided into 2 groups in the level of GD 0.411.

Camellia oleifera; clones; ISSR; finger print

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2016)10-0022-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.005

2015-12-15

广西林业科技项目（桂林科研[2015]38；广西特色经济林培育与利用重点实验室项目（15-A-02-01）；广西林业科学研究院基本科研业务费专项项目（林科201415）

刘 凯，工程师

张乃燕，教授级高工；E-mail：zhangnaiyan333@163.com

刘 凯，张乃燕，王东雪，等. 油茶岑软系列优良无性系的ISSR分子鉴别及遗传分析[J].中南林业科技大学学报，2016,36(10): 22-26.

[本文编校：吴 彬]