水通道蛋白与脊髓水肿的研究进展

王东旭，许卫兵

水通道蛋白与脊髓水肿的研究进展

王东旭，许卫兵

水孔蛋白脂类；脊髓损伤；水肿；综述文献

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）最早由约翰霍普金斯大学医学院的美国科学家PeterAgre于1988年在研究人类红细胞时发现。最初被命名为类通道整合膜蛋白（channel-likeintegralmembraneprotein，CHIP28），1991年10月Carbrey等［1］第一次证明了CHIP28为AQP，确认了其通透水分子的功能，从此AQP的研究正式拉开序幕。目前哺乳动物体内AQP已经发现有13种（AQP-0～AQP-12），而广泛存在于人类中枢神经系统的是AQP-1、AQP-4和AQP9。有研究证明AQP在脑水肿［2］、脊髓水肿［3］等领域发挥着重要作用。通过研究AQP，给脊髓损伤的临床治疗提供帮助。

1 AQP的结构

AQP是一类高度保守的蛋白，作为一个蛋白质家族，各种亚型之间具有非常相似的蛋白序列及三维结构。哺乳动物水通道蛋白的分子大小为26× 106～34×106，氨基酸序列同源性为19％～52％［4］。

目前对AQP-1的研究最多，对AQP的结构研究也以AQP-1为模型。AQP的三维结构，目前被广泛接受的是“沙漏模型”（hourglassmodel）［5］。AQP分子的三级结构可概括为“一链两列五环六区”［5］（见图1）。一链：AQP由1条6次跨膜的肤链构成，其C＇端和N＇端均位于胞内，AQP-1的肤链含有269个氨基酸残基，而AQP-4的肤链则由301个氨基酸残基构成［6］。六区：肤链跨膜是由6个疏水跨膜区完成的，6个疏水跨膜区是以α螺旋的形式往返折叠跨膜。五环：6个疏水跨膜区由A、B、C、D、E，5条撵环依次连接，其中A、C、E环位于胞外，B、D环位于胞内。两列：B、E2环各含有1个高度保守的天冬酞胺—脯氨酸—丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）序列，这是大部分水通道蛋白中构成孔道中心的序列。这个特异的序列在三维结构上位于通道的核心，因此B、E环的任何变化都会影响到AQP的活性（见图2）。但也有例外，AQP-11、AQP-12中仅含有1个NPA序列，通道的另一侧则分别由天冬酞胺—脯氨酸—半胧氨酸（Asn-Pro-Cys，NPC）和天冬酞胺—脯氨酸—苏氨酸（Asn-Pro-Thr，NPT）的氨基酸序列组成［7］。

图1 AQP结构示意图Fig.1 SchematicdiagramofAQPstructure

图2 AQP沙漏模型示意图Fig.2 SchematicdiagramofAQPhourglassmodel

在体内AQP主要以同源四聚体的形式存在，与一般的离子通道不同，这4个亚单位并非环绕形成水通透的孔道，而是每个亚单位均独立构成孔道结构，并且可以完成水通透等生理功能［8］。

2 AQP的分类与分布

根据AQPs家族成员一级结构及转运功能可将其分为3类［1，7，9］：单纯AQP（water-selectiveAQPs）、水甘油通道蛋白（aquaglyceroporin）［1］和超水通道蛋白 （S-aquaporin/super-aquaporin）［9］。AQP-0、AQP-1、AQP-2、AQP-4、AQP-5、AQP-6属于第一类，每个基因都含有4个外显子，它们的外显子与内含子的连接部位相同，该组成员只对水有通透性。AQP-3、AQP-7、AQP-9、AQP-10属于第二类，每个基因都含有6个外显子，其外显子与内含子的连接部位和第一类水通道不同，该组成员对水和甘油皆有通透。AQP-8基因同样含有6个外显子，但外显子和内含子的大小和连接部位与前两类均不同［10］，Carbrey等［1］在文献中也并未将AQP-8划入前两类。第三类包括AQP-11、AQP-12，由于其发现较晚，目前对其功能和结构尚未完全了解。

而根据AQP功能能否被汞所抑制，其又可分为汞敏感性蛋白和汞不敏感性蛋白（mercury insensitivewaterchannel，MIWC）。目前已知，AQP-4 和AQP-7为MIWC，这是因为其他AQP的第189位氨基酸残基是半胧氨酸，可与汞结合从而堵塞水通道，而AQP-4和AQP-7在该位置无半胧氨酸，故对汞制剂不敏感［8］。

在中枢神经系统内存在着广泛的AQP分布（见表1）［4，11］。通过免疫荧光技术可以证实，在中枢神经系统的组织中AQP-1主要在脉络丛脑脊液侧上皮细胞内表达，与基底侧的碳酸醉酶和钠泵共同参与脑脊液的形成［2］。AQP-4有2个主要表达区域：①位于形成胶质界膜的致密星形胶质细胞足突上，参与形成与脑脊液接触的软脑膜和室管膜表面屏障。②位于包绕血管周围的星形胶质细胞足突上，并在与血管直接接触的足突上呈极性分布［12］。AQP-9主要表达于脑和脊髓白质部分的星形胶质细胞，最近发现神经元中也存在AQP-9。已有研究证明增加AQP-9可能有助于创伤性脑损伤早期过量的水和乳酸清除，而广泛AQP-9阵性的星形胶质细胞可能有助于乳酸进入神经元，在创伤性脑损伤的后期导致细胞性脑水肿。AQP-9阵性神经元提示AQP-9在脑外伤后能量平衡方面具有作用［11］。

3 中枢神经系统内AQP的生物学特性

AQP依靠锚定蛋白α-synirophin锚定在神经胶质细胞膜上，锚定在胞膜上的AQP对水分子具有高度的选择性。其具体机制表现在：①在AQP的中心孔道，B环和E环上NPA相互作用形成狭口，最窄处仅由4个氨基酸残基（亲水的His180、Arg195、Cys189和疏水的Phe56）构成，大小约2.8×10-10m。②阻断通过“Grotthus”效应传递的质子运输［13］。水可以以连续不断的方式通过膜上的开放孔，这种水分子排列成1条直线，质子由一个水分子传递到另一个水分子，并伴随着氢键的断裂和重建的过程被研究者称为“Grotthus”效应。但是，在AQP的中心位置NPA序列上的Asn76和Asn192的氨基向通道最窄处延伸，位于此处的水分子与其邻近的水分子之间的氢键发生断裂，此时这一对偶极子与氧原子形成氢键，使水的分子轨道发生重排，中心处水分子的2个氢原子无法与周围邻近的水分子形成氢键，从而对水分子起着定向作用。③从理论上讲水合化的离子直径为7.6×10-10m，而去水合化的离子的直径只有1.9×10-10m，是可以通过最窄处为2.8× 10-10m的中心通道的。中心孔道中的淡基氧的结构虽然足以分离体相水中的水分子，但是只能使水合离子部分去水合化，而后者则因直径仍大于狭口直径而无法通过水通道［8］。

表1 AQP的组织分布以及可通透的物质Tab.1 DistributionandFunctionofAQPs

4 中枢神经系统内AQP的功能

4.1 参与脑脊液的形成

以往认为脑脊液的生成主要是与AQP-1有关，AQP-1主要表达在产生脑脊液的脉络丛上皮细胞上，AQP-1敲除使脉络丛渗透性降低，并使脑脊液产率下降，表明AQP-1参与调节脑脊液的形成［2］。但是最近关于脑脊液平衡的研究强调毛细血管周围间水通量对脑脊液产生和重吸收的重要性（Oreskovic andKlarica假说），这一假说已经向经典的脑脊液循环理论发起挑战。Igarashi等［14］分别敲除小鼠脑内AQP-1和AQP-4基因，并利用水分子MRI等技术在动物实验上表明，水进入脑脊液是受AQP-4调控，而不是AQP-1。

4.2 参与脑与脊髓水肿的形成与发展

AQP参与中枢神经系统水肿已经有较多的研究报道：①细胞毒性脑水肿。将小鼠的AQP-4基因敲除后研究发现，AQP-4缺乏可减轻脑细胞水肿，可以改善由水中毒和局限性脑缺血带来的后果［15，16］。②血管源性水肿。在冻伤、脑肿瘤等模型中，由于AQP-4的缺乏，细胞外液不能及时被转运出脑组织，加剧了脑水肿的发展［15-16］。③间质性脑水肿。在梗阻性脑积水的动物模型中，AQP-4基因敲除小鼠与野生型小鼠相比较发现，其脑室扩大明显加快［17］。

4.3 参与易化星形胶质细胞的迁移

表达AQP-1或者AQP-4的细胞能够更迅速的迁移。大脑受到损伤后，中枢神经系统中的活性星形胶质细胞在AQP-4的协助下向受损的部位迁移并形成胶质瘫痕。对于脊髓损伤目前前沿的疗法是采用干细胞移植进行治疗，如何将干细胞引导到所需部位是移植的关键问题。有证据表明，脊髓损伤后在病变部位周围的反应性星形胶质细胞AQP-1表达显著增加，而远离病变部位的反应性星形胶质细胞表达AQP-1明显要低［18］。

5 AQP的调节

5.1 磷酸化调节

AQP-4上具有大量蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）、钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ（calcium/ calmodulindependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ）、蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）、酪蛋白激酶Ⅱ（caseinkinaseⅡ，CKⅡ）磷酸化位点。以PKA为例，在某些因素作用下腺昔酸环化酶被激活后使细胞cAMP增加，从而激活PKA，PKA催化水通道蛋白上的特定的丝氨酸残基（Ser111）磷酸化，从而使AQP的活性上升，增加膜对水的通透性［19］。用PKC激动剂12-O-十四烷酞佛波醇-13-醋酸酯处理星形胶质细胞，可以使AQP-4和AQP-9的表达减少。但这种作用可以被PKC抑制剂所抑制，提示PKC发挥作用的信号转导途径在AQP-4和AQP-9表达的转录水平而不涉及蛋白质的从头合成［20］。

5.2 pH对AQP的调节

pH是哺乳动物体内调控蛋白活性的一种普遍方式。水通道蛋白的A和C环外部的组氨酸决定其pH值的依赖性。不同AQP中组氨酸的位置可以调节其对酸碱的敏感性［21］。

5.3 缺氧对AQP的调节

低氧诱导因子（hpoxiainducingfactor，HIF）在AQP-1基因的启动区有结合位点。Higashida等［22］的动物实验表明低氧会下调小鼠脑内AQP-1的mRNA和蛋白表达，再次给氧后，AQP-1水平迅速恢复。并且在周围神经系统内HIF-1α参与AQP-1基因缺氧诱导的表达也被研究者所证实［23］。

5.4 渗透压对AQP的调节

Lanaspa等［24］通过向培养基中添加NaCl达到高渗，可以使肾髓质细胞的AQP-1表达大幅上提，表明渗透压调节AQP-1是发生在转录和翻译水平。并且他们发现在AQP-1外显子上游811bp处有一保守的渗透压元件结合蛋白（TonEBP）结合位点。

5.5 其他

应用高剂量激素治疗腹膜透析患者AQP-1的表达上调，但是关于糖皮质激素对AQP表达调节的机制尚不十分清楚。汞可抑制AQP-1和AQP-9的水通透性，但对AQP-4无效；铅可增加AQP-4的水通透性。泛醒可调节AQP-1的表达。

6 AQP在脊髓水肿中的作用

虽然在啮齿类动物神经系统内有AQP-1、AQP-4和AQP-93种水通道蛋白，但是在人的脊髓内目前仅发现AQP-4，因此目前对影响脊髓缺血再灌注损伤的AQP的研究集中在AQP-4上。在脊髓中AQP-4仅由星形胶质细胞表达，然而它不仅像在中枢神经系统的其他器官那样集中在血管周围的终足膜，而且它也沿着神经纤维网的突起广泛分布［25］。已有研究发现AQP-4在脊髓损伤过程中呈现高表达情况，损伤早期AQP-4迅速升高，造成脊髓急性水肿，影响脊髓的正常功能［26］。脊髓损伤后会发生不同程度的血管源性水肿，研究发现脊髓损伤后1d，AQP-4及其mRNA表达开始增加，脊髓损伤后3d达高峰，对应的病理改变为细胞内水肿的形成［27］。水肿的程度和持续的时间与继发性脊髓损伤的发生发展密切相关。因此，通过研究影响水肿的AQP，可以更好地揭露继发性脊髓损伤的机制，从而找到减轻脊髓缺血再灌注损伤的方法。

尽管脊髓AQP功能障碍可能加重脊髓损伤后的水、离子严重失衡，但是AQP在脊髓损伤方面的具体作用依然了解甚少。Nesic等［28］利用GFAP标记AQP-4阴性星形胶质细胞和AQP-4过表达星形胶质细胞发现，AQP-4阴性星形胶质细胞可能产生在脊髓损伤引起的胶质细胞缺失后的代偿过程，并且数量随着时间变化。渐渐的，AQP-4阴性星形胶质细胞会被代替或者转变为AQP-4过表达星形胶质细胞，这主要发生在慢性继发性损伤阶段。尽管AQP-4过表达意味着细胞毒性水肿给神经元或者轴突兴奋性带来负面影响，但是脊髓损伤大鼠更好的运动功能恢复不与AQP-4低水平相关。因此推断，抑制AQP-4对轻度脊髓损伤会有所帮助，但对中、重度脊髓损伤意义不大［27］。

7 展望

AQP的发现至今已有20余年的历史，对其结构与生物学功能的研究已取得了一定进展。目前研究者正在尝试以AQP为靶目标，通过基因敲除干扰转基因和开发AQP抑制或激活药物，从而达到治疗神经系统疾病的目的。是否能够在脊髓水肿急性期时抑制AQP-4介导水流的内流，而在脊髓水肿形成后加速AQP-4介导水流的外流，从而减轻脊髓水肿，这也是目前实验的一个研究方向。总之，AQP作为脊髓损伤治疗的新型药物作用靶点具有潜在的研究价值并可能成为脊柱骨折等所致脊髓损伤治疗的新策略。

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R651.21

A

1672-2957（2015）04-0250-04

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10.3969/j.issn.1672-2957.2015.04.014

2014-05-06）

（本文编辑 张建芬）

国家自然科学基金面上项目（81271394）

王东旭（1988—），硕士在读

116033 辽宁，大连医科大学附属大连市中心医院脊柱外科

许卫兵 xuweibingsmmu@163.com