家兔Cep55基因与其生长发育性状的关联性分析

陈定超 ，杨 嵩 ，沈峻宇 ，冉 强

（1.四川省阆中市畜牧食品局，四川 阆中 637400；2.四川省畜牧总站，四川 成都 610041；3.四川省南充市顺庆区畜牧局，四川 南充 637000；4.四川省汶川县农业畜牧和水产局，四川 汶川 623000）

1 材料和方法

1.1 实验材料采集 选择四川农业大学科研兔场饲养的新西兰兔为实验动物，采集0.5cm2大小的耳组织为实验材料，将采集的耳组织投入盛有75%酒精的EP管内，放入冰盒中带回实验室，于-20℃保存备用。随机采集了416个样本，公母各半。

1.2 各种试剂盒及主要试剂 提取组织中的全基因组用美国Axyen公司的Genomic DNA Miniprep试剂盒，PCR产物凝胶回收试剂盒为OMEGA公司的E.Z.N.A.TM胶回收试剂盒。Taq DNA聚合酶购至北京 艾 德 莱 公 司 ，6×Loading Buffer、Golden View 和DNA Marker 2000购至北京天根公司，琼脂糖和DECP购至大连宝生物公司。常规的氢氧化钠、氯化钠、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA的抽提及检测

1.3.1.1 基因组DNA的抽提 采用Genomic DNA Miniprep Kit基因组提取试剂盒提取家兔全基因组DNA，抽提前对实验所需器材进行高温灭菌处理。抽提过程详见试剂盒说明书。将抽提好的DNA进行分装，转移50μL至新的EP管中用于检测及近期使用。

1.3.1.2 DNA浓度和纯度的检测 使用Nano Vue超微量核酸蛋白仪对DNA浓度和纯度进行快速检测。选择用于检测DNA浓度和纯度的相应程序后，取2.5μL Eluent缓冲液，直接在仪器的点样表面点样检测，检测后，用擦镜纸擦拭干净，重复3次，进行系统调零校正。每次取待测DNA样品2.5μL进行检测，每个样品重复3次，记录DNA的浓度值和OD260/OD280比值。OD260/OD280比值是反映DNA纯度的指标，越纯DNA样品的OD260/OD280比值越接近1.8。质量较好的DNA样品，其OD260/OD280比值在1.6～1.8范围之内。如果比值大于1.8，说明还有RNA的存在，可用RNA酶进行处理；若比值小于1.6则说明样品中有蛋白质或酚的残存，可再用苯酚/氯仿或乙醚处理；可能还会出现比值为1.8，但实质DNA中既有蛋白质又含RNA的情况。因此，结合琼脂糖凝胶电泳检测结果可以准确地确定DNA的浓度和纯度。

1.3.2 引物设计和合成 根据NCBI上提供的家兔Cep55基因的DNA序列（ Genbank ID：XM_002718513.2），先针对该基因的部分功能区域用Primer 5设计引物进行多态性检测（表1），所有引物的合成都由华大基因公司完成。并且针对每对引物，根据公司预测的最适退火温度设计恰当的温度梯度进行梯度PCR。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，先根据扩增条带和Maker的相对位置确定PCR产物是否为目的条带，再观察条带的清晰度和亮度，选择最佳的退火温度。

1.3.3 PCR扩增体系和程序 选择好最佳退火温度后，对DNA进行PCR反应，送测序，以期通过DNA水平检测到SNP位点。PCR反应体系10μL，包括2×Taq PCR Mix 酶 5 μL，上、下游引物（ 10 pmol/μL） 各0.4μL，DNA 模板 1μL，加去离子水（ ddH2O）至 10μL。PCR反应程序：95℃预变性 3 min；95℃变性35 s，55℃退火 30s，72℃延伸 60s（ 共 38个循环）；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

表1 PCR引物序列

1.3.4 PCR产物的检测 取2 μL PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，同时加入DL2000 Marker共泳作分子量的对照，180V电泳7min，在凝胶成像系统中观察电泳结果，并拍照保存。

在抽提的DNA样品中随机选取16个样进行常规PCR反应后，将PCR产物每4个样混合在一起，进行PCR产物混合测序，并检测遗传多态性。全部分装好后，将4管样送至华大基因公司测序。

1.3.5 产物基因型判定 凝胶电泳判定基因型是根据单链DNA片段的空间构象不同来实现分离的，与DNA的分子量大小和带电无关。PCR产物在被限制酶内切后，野生型个体应该产生被切断的两条电泳条带，突变杂合子有3条带，而突变纯合子只有PCR产物一条带。

1.3.6 序列测定 将分辨出来的不同基因型各选一个个体，进行 30 μL体系的 PCR反应，反应体系为10 μL体系各试剂添加量的3倍，然后将得到的PCR产物送相关基因公司纯化测序。

1.4 数据处理

1.4.1 主要分子生物学软件 用Oligo7软件设计PCR扩增引物，运用DNAman软件进行序列保存和查看，用Chromas软件来看测序的峰图，用Multiple sequence alignment软件进行多序列的相似性比对，用Statistics Analysis System 9.3软件包和SPSS 12.0对实验数据做统计分析。

1.4.2 结果分析指标 基因型频率和等位基因频率的计算；遗传多态性分析：遗传纯合度、杂合度、有效等位基因数、多态信息含量的计算。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的抽提与检测 结果见图1。只有当紫外灯下观察到单一且明亮的条带时，才可顺利进行后续实验。

图1 基因组DNA电泳检测结果

2.2 外显子 3、6、9的PCR扩增及电泳 利用表 1的引物，以基因组DNA为模板分别扩增得到外显子3、6、9的 PCR产物。 外显子3、6、9的 PCR产物的电泳图结果如图2所示。

2.3 DNA水平上的遗传多态性研究

2.3.1 DNA上突变位点的发现 在DNA水平上设计3对引物，检测Cep55基因所有外显子区域的多态性位点。经序列比较分析，总共发现Cep55基因编码区存在5个变异位点，均位于外显子9的3′UTR区上， 分别为 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A和c.2227A>G。

图2 外显子3、6、9的PCR产物电泳图

2.3.2 家兔Cep55基因各突变位点基因型的确定 序列用Seqman软件比对，在测序图中找到相应的突变位点，根据峰图中突变位点的峰值以及单双峰情况来确定基因型。纯合子突变位点的测序峰为单一峰型，而杂合子突变位点的测序峰为套峰，杂合子的两个峰比两种纯合子的峰都要低。其中c.2012C>G位点的峰图如图3所示。从图中可以看出，该位点上存在一个C/G的突变，其中CC为野生型，CG为杂合突变型，GG为突变纯合子。

图3 外显子9 c.2012C>G测序峰图

对外显子9重新随机选取24个样品进行常规PCR反应，反应体系为30 μL，之后将产物送往华大基因公司进行单管测序。图4为单管测序样品的PCR电泳图。

图4 外显子9 PCR产物电泳图

2.3.3 c.2012C>G位点与家兔不同生长阶段日龄重及35～84日龄平均日增重的关联性分析 根据SNP位点周边序列特点，在c.2012C>G位点采用PCRFRLP技术对416个个体进行基因分型，得到三种基因型的个体数分别为 CC（ 114）、CG（ 269）、GG（ 33），其等位基因频率、基因型频率及多态信息含量见表2。由表2可知，C等位基因频率为0.60，G等位基因频率为0.40。三种基因型CC、CG、GG的基因型频率分别为0.27、0.65和0.08。遗传杂合度（He）、多态信息含量（ PIC）以及有效等位基因数（ Ne）分别为 0.4815、0.3025（中度多态）和1.9285。

表2 c.2012 C>G位点的等位基因、基因型频率及多态信息含量

采用最小二乘法分析Cep55基因c.2012 C>G位点与家兔不同生长阶段生长性状的相关性，结果见表3。

表3 基因型与不同日龄体重的最小二乘均方计算结果

注:ADG为35～84日龄的平均日增重，数据用平均值±方差表示；同行肩标不同字母表示不同的差异显著性水平。

3 讨论

3.1 候选基因的筛选 生长性状受多基因控制，目前已发现一些基因如GHR、FTO、MSTN等与家兔生长性状相关，但这只是影响生长性状的部分基因[1]。本实验首先通过检测Cep55基因不同基因型与不同生长阶段的家兔生长发育情况的关系，确认Cep55可以作为家兔生长发育性状的候选基因。Cep55基因调控细胞周期进程，对细胞的分裂速度和生长因子反应等多个方面都起着十分重要的作用。

3.2 基因型和生长性状的关联分析 从实验数据我们可以发现，56日龄以前，各基因型之间个体重的数值相差不多，但是到了生长后期，不同基因型之间的差距就明显表现出来了，但是同一基因型个体在不同阶段的生长速度比较均衡。

CG基因型的个体在40日龄前的个体重大于CC基因型的个体，但是40日龄之后，CC基因型的个体重就逐渐开始大于CG基因型的个体重，而且随着日龄的增大差距越来越大。说明CG基因型个体的早期生长速度较快，但是CC基因型个体的后期生长速度明显大于CG基因型的个体。而GG基因型的个体在出栏前的整个生长周期内，其生长速度都很缓慢。可见等位基因C具有促进家兔生长发育的作用。

3.3 UTR区的相关研究 随着后基因组时代的到来，非编码区的研究已经成为科学家面临的挑战，对基因非编码区的一个主要研究方向就是对调控元件的研究。识别转录调控元件是理解基因转录机制和表达模式的关键。虽然人们已经了解了基因的结构，掌握了遗传密码，但对于非编码区还了解很少，普遍认为它们与基因在四维时空的表达调控有关[2]。大量的研究发现，3′UTR区对基因有调控表达作用[3-5]。

4 结论

通过本实验研究及统计分析，我们初步得出以下结论：

4.1 在新西兰兔Cep55基因的外显子9中共发现了5个多态性位点，均位于外显子9的3′UTR区，分别为 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A 和c.2227A>G。

4.2 Cep55基因外显子9上的5个多态性位点完全连锁。

4.3 Cep55基因外显子9的5个位点均属于中度多态。

4.4 关联性分析表明，CC基因型在家兔的生长后期有显著的增重效应，而GG基因型的几乎所有生长阶段的个体重均显著低于其他两个基因型，说明Cep55基因外显子9序列的突变位点可作为家兔生长性状的遗传标记。

4.5 3′UTR区可能作为调控元件影响家兔生长的相关性状。

[1]Peng J， ZhangW X， Zhang G W， et al.Papid genotyping of MSTN gene polymorphism using highresolution melting for association study in rabbits[J].Asian Austral J Anim，2013，26（1）:30-35.

[2]马志强,崔颖,马雅楠，等.基因非编码区与转录调控元件的识别研究[J].生物信息学，2008（4）:187-189.

[3]安雅臣,冯福民,袁聚祥.NRAMP1基因INT4和3′UTR位点多态性与肺结核易感性的研究[J].中华流行病学杂志，2006，27（1）.

[4]赵巧辉,陈其新,李明，等.家兔 BMP7基因3′UTR的克隆及序列分析[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2009（2）:28-34.

[5]杨具田,徐红伟,臧荣鑫，等.五个地方绵羊品种FAS基因3′UTR区单核苷酸多态性研究 [J].中国农业科学，2010，43（13）.