PCR方法扩增种属特异性片段检测牛羊肉成分

晏华春，马晓燕，刘艳芳，依明·苏来曼（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

PCR方法扩增种属特异性片段检测牛羊肉成分

晏华春，马晓燕，刘艳芳，依明·苏来曼
（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

为建立市场上各种熟肉制品成分的检测方法，利用PCR方法比对牛、鸡、羊、猪的DNA基因组序列，确定了针对4种常见肉类的特异性检测引物。结果表明：获得的引物具有特异性强的特点，建立的PCR检测方法样品用量少、结果准确，适合应用于特异性检测。

PCR扩增；特异性检测；模板DNA；熟肉制品

新疆是多民族聚住的地区，各民族的饮食方式和习惯有所不同。本研究的目的是建立各种熟肉制品成分的检测方法，为广大人民的饮食需求提供某种程度上的理论知识。

在市场中，消费者经常会遇到以鸡肉冒充猪肉、以猪肉冒充牛羊肉等、用低价劣质的肉冒充高价优质肉的欺骗行为，这些单位或个人为追求自身利益而极大地损害了消费者的利益和健康［1］。目前，质监部门主要通过传统的鉴别方法，对肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源判别，对市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用［2］。然而，对于很多熟肉制品（如香肠）来说，运用传统的方法却无法进行准确鉴定。因为熟肉制品加入的肉经过了粉碎处理，并且添加香料及其他调料，掩盖了原有的味道，质量难以鉴定。因此，国家及地方各级质监部门急需建立一种分析食品中肉类来源的快速、有效的检测方法。

蛋白质鉴定和分子遗传学鉴定是目前肉制品品种鉴定的两个主要方法，其中分子遗传学鉴定方法是当前研究的热点，主要的原因是DNA比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出小片段DNA，而多数蛋白质会发生变性，无法满足鉴定需要。分子遗传学鉴定方法可以根据实验目的选择不同的目的基因进行研究，不依赖于组织和细胞的类型，不同的基因片段进化效率不同，DNA比蛋白质具有更高的种间多态性，有利于品种鉴定［3］。在食品加工过程中，部分DNA不会被破坏，所以利用PCR法可以不受肉类高温加工的影响。另外，PCR法能够简便快速地完成检测，且成本较低，也易于快速推广［4］。国内陈颖等［5］在检测保健品中牛羊源性成分的过程中使用了PCR方法，所设计的特异性引物对牛成分检测低限为0.05%，甚至可以扩增含有0.005%的山羊成分的样品。杨宝华等［6-7］应用线粒体DNA的特异性建立分析饲料中蛋白牛羊来源的PCR方法，通过不同肉类来源的线粒体基因比对，确定针对猪、牛、羊、鸡线粒体基因的特异性引物。应用PCR技术对熟肉制品的肉类来源检测具有取样少，所选引物特异性强，灵敏度高的优点［8］。通过对市场上的一些熟肉制品的随机检测，结果表明大多数正规厂家的熟肉制品的肉类来源基本可靠。以PCR为基础的各种分子生物学方法具有很高的灵敏度和特异性，这些方法先后应用于肉制品的种属鉴定中，为食品监管部门判定肉制品掺假造假提供了技术支持，其中一些方法有较强的实用性，已经或可能作为肉制品鉴定的标准方法。基因芯片、芯片实验室和实时PCR技术能实现从混合物中快速、定量检测物种成分，将成为肉制品种属鉴定的主要发展方向。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，PCRMix，MARKER，1.5%琼脂糖，2%琼脂糖，10×TBE，T10E10，T10E1，USSTE裂解液，70%的乙醇，10%SDS，生理盐水，Tris.Cl，0.5mol/L的EDTA，50×TAE，电泳上样缓冲液，等等。

1.2 主要试验仪器

移液器，超净工作台，低温离心机，圆周振荡器，凝胶成像仪，微型离心机，PCR仪，琼脂糖水平电泳槽，电泳仪，电冰箱，微波炉。

1.3 待检测样品

在引物特异性验证过程中，用到的检测样品有市场上肉类制品，如牛肉、鸡肉、羊肉、猪肉、火腿肠、鸡肉肠、牛肉肠等。

1.4 PCR引物的确定

结合现有文献结果，通过分析和比对常见肉类的mtDNA的保守序列，确定了针对不同动物线粒体DNA的特定片段，自己分别设计出了不同种属动物引物，见表1。

表1 不同种属动物的引物

1.5 方法

1.5.1 羊肉DNA的提取方法 ①取15～20mg样品放入离心管内加800μLUSSTE裂解悬浮，用眼科剪刀尽量剪碎组织。②加15μL蛋白酶K，55℃水浴震荡12～15 h，直至无组织块。③每管加等体积饱和酚800μL摇匀10min，低温10 000 r/min离心10min。④取上清液600μL加500μL饱和酚和500μL氯仿异戊醇（24∶1），摇匀10min，10 000 r/min离心10min。⑤取上清液400μL加等体积氯仿异戊醇（24∶1），摇匀10min，10000 r/min离心10min。⑥取上清液200μL加等体积氯仿异戊醇（24∶1），摇匀10min，10 000 r/min离心10min。⑦取上清液100μL加两倍体积冷无水乙醇，摇匀5min，置于-20℃冷冻30min，然后12 000 r/min离心10min。⑧弃去上清，加500μL 70%的乙醇浸洗2次（除杂质）。⑨弃去上清，自然干燥30min。⑩待乙醇晾干后加50μL T10E1，37℃溶解沉淀，贮存4℃或-20℃。

1.5.2 火腿肠、鸡肉肠、牛肉肠等的DNA提取方法 ①取15～20mg样品放入离心管内加400μLUSSTE裂解悬浮，200μLT10E10，70℃温浴10min。②加等体积氯仿异戊醇（24∶1），摇匀10min，10 000 r/min离心5min。③取上清液，加等体积冷无水乙醇，摇匀5min，置于-20℃冷冻10min，然后10 000 r/min离心5min。④弃去上清，加500μL 70%的乙醇浸洗2次（除杂质）。⑤弃去上清，自然干燥30min。⑥待乙醇晾干后加50μL T10E1，37℃溶解沉淀，贮存4℃或-20℃。

1.5.3 PCR检测 将设计好的引物分别与提取到的生羊肉、熟猪肉、熟牛肉、熟鸡肉DNA进行PCR扩增反应，并对产物进行检测。具体方法如下：以牛肉DNA与牛引物的反应为例。取牛DNA等量加入100μL无菌PCR管中，加入牛引物（正向和反向引物均相等）。在每个PCR管中加入适量含Tap DNA酶、dNTPs等的2×master，然后再加入无菌双蒸水稀释。将反应体系放入PCR仪中，设定不同的变性、退火和延伸时间和温度。一般反应的循环参数如表2所示。

表2 PCR检测方法的循环参数

根据引物、模板及反应体系的不同在具体PCR过程中，循环参数会有轻微的波动。反应完毕后将PCR产物取出，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

2 结果

2.1 引物特异性检测

建立用PCR方法检测熟肉制品中肉类来源的方法，需要对合成的引物进行验证，检测其是否可以通过PCR扩增获得目标条带，同时也需要分析引物的特异性和灵敏度，检测其能否满足检测的需要。提取牛、鸡、羊、猪的DNA，分别用牛、鸡、羊、猪的引物进行PCR扩增，电泳结果如图1～4所示。

图1扩增结果表明：牛引物与牛DNA可发生PCR扩增，鸡DNA与鸡引物可发生PCR扩增，羊DNA与羊引物可发生PCR扩增，猪DNA与猪引物可发生PCR扩增。

图1 D-LOOP方法检测牛、鸡、羊、猪DNA的PCR扩增结果

图2扩增结果表明：牛引物与牛DNA可发生PCR扩增，鸡DNA与鸡引物可发生PCR扩增，羊DNA与羊引物可发生PCR扩增，猪DNA与猪引物可发生PCR扩增。

图2 CytB方法检测牛、鸡、羊、猪DNA的PCR扩增结果

2.2 随机检测市场熟肉制品的结果

图3扩增结果表明：鸡DNA与鸡引物可发生PCR扩增；猪DNA与猪引物可发生PCR扩增。

图3 D-LOOP方法检测未知物DNA的PCR扩增结果

图4扩增结果表明：鸡DNA和鸡引物可以发生扩增；猪DNA和猪引物可以发生扩增。

图4 CytB方法检测未知物DNA的PCR扩增结果

3 讨论

本实验所设计的牛、鸡、羊和猪引物只有在同源DNA为模板的情况下能够发生PCR扩增，而不能与非同源DNA发生反应，表明各引物都具有良好的种属特异性。应用PCR方法检测熟肉制品的特异性好。本实验对正规超市中的9种熟肉制品，用合成的特异引物进行了PCR检测，测定结果证实了9种熟肉制品中的肉类来源与标签中的注明相符，说明此方法可以对熟肉制品进行鉴定。2001年，Lahiff等［9］建立了检测饲料中绵羊、猪和鸡成分的DNA方法，用于反刍动物成分的检测，并且在此基础上建立了定量PCR分析方法。Tajima K等采用分散重复序列（SINE）设计了牛、绵羊和山羊的扩增引物，该引物对以上3种动物成分的检测灵敏度达0.01%［10］。Tanabe S等采用定量PCR的方法分析食物中猪、鸡、牛、羊及马肉来源，并且可以实现较为准确的定量。本实验采用了上述研究同样的方法初步检测出了牛肉、鸡肉、羊肉及猪肉等的含量成分，结果与前人的研究结果基本一致。

4 结论

本研究通过比对牛、鸡、羊、猪的线粒体基因组序列，确定了针对4种常见肉类的特异性检测引物。实验证明，获得的引物具有特异性强的特点，建立的PCR检测方法样品用量少，结果准确，适合应用于特异性检测。

［1］ 吴信法.肉的假冒和肉制品掺杂的检验［J］.肉品卫生，2002（4）：30.

［2］ 林世武，李学花.羊肉和猪肉的快速鉴定方法［J］.肉品卫生，2002 （9）：36.

［3］ 李文静，李燕俊.分子学方法鉴定肉制品种属来源的研究进展［J］.国外医学（卫生学册），2009（3）：151-158.

［4］ 韩敏义，康明丽.PCR在肉类科学中的应用［J］.畜牧与饲料科学，2009，30（9）：57－60.

［5］ 陈颖，吴亚君，徐宝梁，等.进出口动物源性产品中牛羊成分的检测方法［J］.食品工业科技，2004，25（8）：143-145.

［6］ 杨宝华，宗卉，林庆燕，等.用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分［J］.中国畜牧杂志，2002，38（1）：3-5.

［7］ 孙艳华，张智禹，牛晋阳，等.PCR法检测肉制品中肉类来源的灵敏度研究［J］.食品工业，2013（3）：93-95.

［8］ 侯东军，杨红菊，姜艳彬，等.PCR鉴定牛羊肉中掺杂猪肉的方法建立［J］.食品工业科技，2009，30（3）：328-330.

［9］ Lahiff S，Glennon M O B L，Lyng J，etal.Species specific PCR for the identification of ovine，porcine and chicken species inmeat and bone meal（MBM）［J］.Molecularand CellularProbes，2001，15（1）：27-35.

［10］孙艳华，张智禹，牛晋阳，等.PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源［J］.食品研究与开发，2010，5（31）：139－142.

Q75

A

2095-3887（2015）04-0017-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.005

2015-04-28

国家级大学生创新创业训练计划项目（201310758002）

晏华春（1988-），男，硕士研究生。

依明·苏来曼（1971-），男，维吾尔族，副教授，硕士生导师。研究方向：动物遗传育种。