槲皮素通过抑制核因子-κB表达诱导A549细胞凋亡

槲皮素通过抑制核因子-κB表达诱导A549细胞凋亡

袁玫王松1张増雷罗海龙2姜爱英

(牡丹江医学院红旗医院呼吸内科，黑龙江牡丹江157011)

摘要〔〕目的观察槲皮素对人肺腺癌A549细胞核因子(NF)-κB信号通路的影响，探讨其诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡的作用机制。方法体外培养A549细胞，实验分为槲皮素组(给予终浓度为30 μg/ml槲皮素)、顺铂组(给予终浓度为3 μg/ml顺铂)及对照组〔给予等体积二甲基亚砜(DMSO)〕。采用ELISA法检测Caspase-3浓度；采用免疫组化荧光染色检测PARP裂解片段阳性细胞荧光强度；采用 Western印迹分析检测NF-κB蛋白的相对表达强度。结果槲皮素可明显升高Caspase-3浓度、增强多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解片段阳性细胞荧光强度、抑制NF-κB的表达，与对照组差异显著(P<0.05，P<0.01)。结论槲皮素可通过抑制NF-κB表达而诱导A549细胞凋亡，可能是其抗NSCLC的机制之一。

关键词〔〕槲皮素；非小细胞肺癌；caspase-3；多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)片段

中图分类号〔〕R585.5〔文献标识码〕A〔

通讯作者：姜爱英(1981-)，女，硕士，主要从事肺癌的分子靶向治疗研究。

1牡丹江市肿瘤医院内二科2牡丹江医学院红旗医院神经内科

第一作者：袁玫(1973-)，女，副主任医师，主要从事呼吸系统疾病发病机制及其药物治疗研究。

肺癌是目前世界各国常见的恶性肿瘤之一，并且是我国城镇居民死亡的首位原因〔1〕。在肺癌的病理学分型中，80%为非小细胞癌(NSCLC)，包括腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌〔2〕。目前肺癌治疗以手术为主，联合放化疗为辅，但是因老年人肿瘤患病率高，大部分人可能由于机体状况差、肿瘤已存在转移不能耐受及接受手术治疗。且手术费用昂贵，化疗不良反应严重，有些患者尤其老年人难以耐受。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，存在于银杏等许多植物内，具有明确的抗感染、抗血小板聚集、抗氧化作用，并影响多种酶的活性〔3〕。关于槲皮素对肺癌的影响鲜见报道。本研究旨在观察槲皮素对人肺腺癌A549 细胞核因子(NF)-κB信号通路的影响，探讨其诱导NSCLC细胞凋亡的作用机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂人肺腺癌A549细胞购自中科院上海细胞库；DMEM培养基购自美国HyClone公司；槲皮素(纯度>99%)、顺铂、牛血清白蛋白(BSA)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；Caspase-3 ELISA试剂盒购自美国Cayman Chemical公司；兔抗大鼠多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)片段的多克隆抗体购自eBioscience公司，Dylight488-山羊抗兔IgG购自美国Abbkine公司。

1.2试验药物槲皮素溶解于DMSO，配成30 μg/ml溶液，-20℃保存，备用。

1.3细胞培养与分组A549细胞保存在含有10% BSA的DMEM培养基(含L-谷氨酰胺，青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml)，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养。2~3 d传代1次，收集对数生长期细胞接种于96孔板。实验分为槲皮素组给予终浓度为30 μg/ml的槲皮素〔3〕；顺铂组给予终浓度为3 μg/ml的顺铂；对照组给予等体积DMSO(除未加槲皮素外，其余条件与实验组完全一致)，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养继续培养48 h后，用于后续实验。

1.4ELISA检测Caspase-3浓度各组A549细胞处理48 h后，加入预冷的1 mmol/L EDTA溶液(含1%BSA)，4℃ 2 000 r/min离心10 min，取沉渣加入100 μl 10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，冰浴超声3×4 s后，4℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清。按照caspase-3 ELISA试剂盒说明书操作，Bio-R ad550型酶标仪450 nm处测定OD值。根据标准曲线求出Caspase-3浓度。

1.5PARP片段染色各组A549细胞处理48 h后，PBS洗涤3次，每次5 min。4%甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100通透30 min，PBS洗涤3次，每次5 min。室温1%BSA封闭1 h，加入兔抗大鼠PARP片段的多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min。加入Dylight488-山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)室温孵育30 min，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察并拍照，计算PARP片段蛋白荧光强度。

1.6Western印迹分析各组A549细胞处理48 h后，用细胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，1.5% Triton X-100，150 mmol/L NaCl，10%甘油，1 mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF)和蛋白酶抑制剂(5 μmol/L AEBSF-HCl，5 μmol/L EDTA，10 mmol/L leupeptin，1.5 mmol/L E-64，pH7.4)裂解细胞后，收集裂解液，Bradford法测定蛋白质含量。取20 μg蛋白质加入等体积2×上样缓冲液，95℃变性5 min。随后进行7.5%SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后，电转至0.45 μm硝酸纤维素膜，用含5%的脱脂奶粉PBST(25 mmol/L Tris pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20)封闭1 h，加入NF-κB/p65兔源单克隆抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次5 min。加入HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min。按同样的方法与β-actin抗体孵育。化学发光试剂显色，通过bio-rad凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。NF-κB/p65蛋白的相对表达强度=NF-κB/p65蛋白表达强度/蛋白表达强度β-actin。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2结果

2.1槲皮素对A549细胞Caspase-3浓度的影响槲皮素组和顺铂组Caspase-3浓度〔(21.35±5.27)μg/L和(25.76±5.92)μg/L〕明显高于对照组〔(3.28±0.83)μg/L〕(P<0.05，P<0.01)；槲皮素组与顺铂组差异不显著(P>0.05)。

2.2免疫组化结果PARP片段染色以核染为主，阳性细胞呈绿色荧光，槲皮素组和顺铂组PARP 片段阳性细胞数明显较对照组增多，而对照组阳性细胞较少。见图1。槲皮素组和顺铂组PARP 片段阳性细胞荧光强度〔(23.85±6.49)A.U和(35.71±8.16)A.U〕明显高于对照组〔(11.26±3.84)A.U〕(P<0.05，P<0.01)；槲皮素组与顺铂组差异不显著(P>0.05)。

图1　各组PARP 片段免疫组化结果(×10)

2.3槲皮素对A549细胞NF-κB/p65蛋白水平的影响槲皮素组和顺铂组NF-κB/p65蛋白水平〔(0.87±0.21)和(0.92±0.29)〕明显高于对照组(0.37±0.08)(P<0.05，P<0.01)；槲皮素组与顺铂组差异不显著(P>0.05)。见图2。

图2　槲皮素对A549细胞NF-κB/p65蛋白水平的影响

3讨论

机体维持各种细胞的平衡主要是通过细胞增殖与凋亡来实现的，这种平衡的维系一旦被打破可能引起一些疾病的发生，例如肿瘤。肿瘤细胞凋亡的抑制是肿瘤发生、发展的一个非常重要的因素，故此诱导肿瘤细胞的凋亡必定是治疗肿瘤的中药手段之一。NF-κB是一种具有多向调节功能的转录因子，NF-κB活化后可以诱导恶性肿瘤细胞产生抗凋亡蛋白，并且减少凋亡相关蛋白的表达量，提示NF-κB在恶性肿瘤进程中起抗凋亡作用，是目前肺癌研究的热点〔4〕。NF-κB通常以同源或异源二聚体形式出现，其中以p50/p65分布和作用最广泛，p50是NF与DNA结合的部分，p65是与抑制蛋白结合的部分〔5〕。由于p65参与基因转录的起始调节，并可促进 p50 与 DNA 结合，其在细胞核内的表达一定程度上反映 NF-κB的活性〔6〕。本研究结果提示槲皮素诱导A549细胞凋亡与抑制NF-κB/p65表达有关。

Caspase-3广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中，处于细胞凋亡的下游，正常情况下以无活性的形式存在，但是当细胞发生凋亡时其变为活性形式，是执行细胞凋亡的主要酶类，绝大部分细胞凋亡依赖于该酶的存在，Caspase-3一旦激活，凋亡便不可逆转地发生〔6，7〕。Caspase-3激活可诱导白血病细胞、结肠癌细胞、NSCLC细胞凋亡〔8~11〕。本研究说明槲皮素可能通过激活Caspase-3而诱导NSCLCA549细胞凋亡。

PARP为Caspase-3的底物，因caspase-3的活化将导致细胞发生凋亡性死亡，所以PARP又被称为“死亡底物”〔12〕。PARP是真核细胞内具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基催化活性的蛋白酶，具有维持染色体稳定、DNA损伤修复、基因转录、细胞增长、死亡和凋亡等作用。PARP作为caspase-3的底物参与凋亡，PARP被caspase-3剪切为25 kD和89 kD大小的2个片段，PARP活性消失，丧失DNA修复功能，导致DNA损伤以及细胞凋亡〔13〕，PARP片段可以作为细胞凋亡的分子标志。Nakajima等〔14〕实验表明，PARP 可与NF-κB形成复合物，从而使NF-κB DNA 结合位点暴露然后转位于细胞核，上调细胞黏附分子等依赖NF-κB基因的转录，使其表达增加。本研究结果说明槲皮素可使PARP的裂解增加，表达降低。

综上，槲皮素抗NSCLC的机制可能是：①槲皮素通过激活Caspase-3蛋白，将PARP切割降解，从而使具有DNA修复功能的PARP失去修复DNA的功能诱导A549细胞凋亡；②槲皮素使PARP裂解增加，表达降低从而抑制NF-κB基因转录，表达降低促进A549细胞凋亡。至于槲皮素是否通过其他机制诱导A549细胞凋亡，例如基质金属蛋白酶-2和-9，还待进一步研究。

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14Nakajima H，Nagaso H，Kakui N，etal.Critical role of the automodification of poly (ADP-ribose) polymerase-1 in nuclear factor-kappaB-dependent gene expression in primary cultured mouse glial cells〔J〕.J Biol Chem，2004；279(41)：42774-86.

〔2014-03-19修回〕

(编辑苑云杰)