EGCG对刀豆蛋白A诱导肝损伤小鼠CXCR3表达的影响

EGCG对刀豆蛋白A诱导肝损伤小鼠CXCR3表达的影响

刘冬梅张晶孙玥

(中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科，辽宁沈阳110004)

摘要〔〕目的观察EGCG对刀豆蛋白A(ConA)诱导的肝损伤小鼠肝组织中CXCR3表达的影响。方法C57BL/6小鼠分成4组：正常对照组、表没食子儿茶素酸酯(EGCG)对照组、ConA模型组，EGCG+ConA模型组。EGCG对照组及EGCG+ConA模型组小鼠造模前给予EGCG口服(5 mg/kg)，10 d后两组模型组小鼠通过静脉注射ConA(15 mg/kg)建造肝损伤模型，采血及留取肝组织，HE法检测肝组织病理变化，ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)α，干扰素(IFN)-γ及CXCR3的水平，免疫组化法检测肝组织中CXCR3的表达。结果ConA模型组小鼠肝损伤明显，TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表达明显增多，与其他组比较有差异显著(P<0.05)；EGCG干预的模型组肝损伤减轻伴TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表达下降，与ConA模型组比较差异明显(P<0.05)。免疫组化结果同样显示ConA模型组CXCR3的表达明显增多，EGCG治疗后表达减少。结论EGCG对ConA诱导的免疫性肝损伤小鼠有保护作用，其机制可能与调节CXCR3的表达有关。

关键词〔〕EGCG；刀豆蛋白A；肝损伤；CXCR3

中图分类号〔〕R575.1〔文献标识码〕A〔

第一作者：刘冬梅(1975-)，女，副主任医师，博士，主要从事自身免疫性疾病研究。

植物凝集素刀豆蛋白A(ConA)诱导的实验小鼠肝损伤模型与人类自身免疫性肝炎(AIH)及病毒性肝炎类似，以肝脏聚集CD4+T细胞为主，介导了肝脏的免疫性损伤〔1〕。近年来，趋化因子受体及其家族在炎性疾病中的作用越来越受到人们的关注，其中CXCR3是一类较具代表性的趋化因子。有研究发现，许多慢性肝脏疾病中CXCR3相关配体CXCL10显著升高。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从绿茶中提取的一种多酚化合物。研究表明EGCG具有抗炎、抗氧化、抗癌等诸多药理活性，最近有结果显示， EGCG能够通过抑制相关炎症因子的表达减轻ConA诱导的急性肝损伤，但其具体的作用机制并不明了〔2〕。本实验采用静脉注射ConA诱导C57BL/6小鼠建立肝损伤动物模型，给予EGCG进行干预，观察EGCG对小鼠的肝保护作用及对肝组织中CXCR3表达的影响。

1材料和方法

1.1实验动物与主要试剂C57BL/6小鼠(中国医科大学动物部)；Con A及EGCG (Sigma公司)；ELISA试剂盒 (上海信然生物公司)；CXCR3单克隆抗体(Zymed公司)。

1.2动物模型的建立及分组C57BL/6小鼠分4组：正常对照组、EGCG对照组、ConA模型组及EGCG+ConA模型组。EGCG对照组和EGCG+ConA组每天经灌胃给予5 mg/kg的EGCG，2次/d，共10 d，正常对照组和模型组同时给予等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。10 d后，模型组和EGCG+ConA组小鼠经尾静脉注射给予15 mg/kg的ConA，正常对照组和EGCG对照组同时给予等体积的PBS，注射10 h后取各组小鼠外周血并处死取肝组织。

1.3小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测小鼠麻醉后，摘眼球取血，离心后取上层血清，全自动生化仪法检测小鼠血清ALT、AST的水平。

1.4酶联免疫法(ELISA)法检测小鼠肝组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ及CXCR3的水平处死小鼠后留取肝组织ELISA法检测TNF-α、IFN-r及CXCR3的水平。具体参照ELISA说明书进行。

1.5HE染色小鼠麻醉后，无菌取肝脏组织，10%中性甲醛液浸泡，制作成蜡块，包埋、切片、脱蜡至水、苏木素染色、盐酸酒精分化、自来水反蓝、伊红染色、后进行脱水、透明、封片，最后显微镜下观察染色效果，并于200倍下拍照。

1.6免疫组化法检测CXCR3在小鼠肝组织的表达切片常规脱蜡至水,高温高压组织抗原修复,CXCR3抗体按1∶200稀释,常规脱蜡、水化、微波恢复抗原,DAB显色,常规复染封片，用彩色病理图像分析系统采集图像，在高倍镜(×200)下检测,以细胞质、核膜或胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性细胞。

1.7统计学方法采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2结果

2.1EGCG对各组小鼠ALT、AST的影响ConA模型组小鼠ALT、AST、TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平均较正常对照组显著升高(P<0.05)，提示出现了明显的肝损伤。与ConA模型组小鼠比较，EGCG+ConA组ALT、AST的水平降低，肝损伤减轻(P<0.05)。见表1。

2.2各组小鼠肝组织中TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表达ConA模型组小鼠肝脏TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平较正常对照组显著升高(P<0.05)，与ConA模型组比较，与肝损伤一致；经EGCG治疗后小鼠上述指标明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3肝脏结构光镜下的改变正常对照组小鼠肝细胞形态正常，肝小叶结构完整，汇管区正常。EGCG对照组小鼠可见肝细胞形态基本正常，肝小叶结构完整，汇管区正常。ConA模型组小鼠(注射ConA 10 h)后可见肝细胞水肿，充血坏死，肝小叶结构破坏，可见灶性坏死及炎症细胞浸润。EGCG对照组小鼠肝细胞水肿，肝小叶结构可见，偶有不完整，汇管区可见炎症细胞浸润。见图1。

2.4免疫组化结果ConA模型组小鼠肝脏组织细胞内CXCR3的表达明显多于正常对照组和EGCG对照组。 EGCG治疗后CXCR3的表达较模型组减少。见图2。

表1　各组小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IFN-α及CXCR3的水平变化

与正常对照组比较：1)P<0.05，与ConA模型组比较：2)P<0.05

图1　各组小鼠肝组织病理切片的变化(HE，×200)

图2　CXCR3 在各组小鼠肝组织的表达(DAB，×200)

3讨论

ConA可与循环中的巨噬细胞成分组合，活化肝内的T淋巴细胞，释放炎症介质，对肝细胞造成损伤，对肝脏有器官特异性，常用来建造免疫性肝损伤模型。

目前对于免疫性肝损伤的治疗主要有糖皮质激素、免疫抑制剂等，而这些药物由于严重的不良反应使应用受到限制。因此积极寻找一种新的治疗方法和药物具有重要的临床意义。EGCG是茶多酚中含量较高的物质，也是儿茶素类化合物中生物学效应最强的一种，有报道EGCG通过抑制炎性因子的表达减轻了ConA诱导的肝损伤，而炎性因子TNF-α、IFN-γ在ConA诱导的肝损伤过程中具有举足轻重的作用。本实验结果发现经过EGCC治疗的模型组小鼠无论是血清转氨酶还是肝脏形态学改变均明显减轻，同时TNF-α、IFN-γ的表达亦明显减轻，与文献报道一致。

趋化因子是一类可以激发白细胞趋化性的小分子分泌性蛋白质，能够吸引中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎性细胞移动到炎症灶，并增强炎性细胞的吞噬杀伤功能，直接参与炎症过程，并且在肝脏免疫反应尤其是淋巴细胞归巢的细胞间黏附过程中有重要的地位〔3〕。因此对ConA诱导的免疫性肝损伤趋化因子的测定可以间接判断肝脏的损伤程度。IP-10 是新近发现的属于CXC类的趋化因子，CXCR3 是目前发现的IP-10 的唯一受体，所以CXCR3是目前人们研究较多的一类趋化因子。近年研究发现: 在自身免疫性肝病、慢性丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染动物模型中IP- 10、CXCR3 的分泌增加〔4~6〕，而CXCR3仅表达于TH1细胞〔7〕，并且与许多自身免疫性疾病相关。有实验发现，PBC患者肝脏的门脉区有超过半数的CD4+T细胞表达CXCR3〔8〕。Chen等〔9〕在银屑病皮损中，发现CXCR3 mRNA表达增多，其配体CXCL9-11的mRNA水平也明显升高。Henneken等〔10〕在RA患者外周血B细胞中检测到CXCR3水平升高，关节滑液中CXCL9、CXCL10水平亦明显升高。还有人〔11〕在狼疮性肾炎的肾组织细胞中也发现了高表达的CXCR3。

本实验提示CXCR3参与肝损害的发生；而经EGCC治疗的小鼠CXCR3的表达显著下降，与转氨酶及TNF-α、IFN-γ的变化及肝脏形态学变化趋势一致，显示了EGCC在减轻肝损伤的同时降低了肝脏中CXCR3的表达，进一步提示EGCC保护肝脏的作用可能与调节CXCR3的表达有关。

参考文献4

1Miyazawa Y,Tsutsui H,Mizuhara H,etal.Involvement of intrasinusoidal hemostasis in the development of concanavalin A-induced hepatic injury in mice〔J〕.Hepatology,1998；27(2):497-506.

2Zlotnik A,Yoshie O.Chemokines.A new classification system and their role in immunity〔J〕.Immunity,2000；12(2):121-7.

3Shetty S,Lalor PF,Adams DH.Lymphocyte recruitment to the liver:molecular insights into the pathogenesis of liver injury and hepatitis〔J〕.Toxicology,2008；254:134-46.

4Zhai Y，Shen XD，Hancock WW，etal． CXCR3+CD4+T cells mediate innate immune function in the pathophysiology of liver ischemia/ reperfusion injury〔J〕．J Immunol,2006；176(10):6313-22.

5Wang J,Wang PP,Xiang G J,etal． Relationship between the expression of IP-10 and IP-10 mRNA in peripheral blood and HBV DNA level in patients with cirrhosis〔J〕．Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2010；9(3):280-6.

6Diago M，Castellano G，Garcia-Samaniego J，etal． Association of pretreatment serum interferon gamma inducible protein 10 levels with sustained virological response to peginterferon plus ribavirin therapy in genotype 1 infected patients with chronic hepatitis C〔J〕.Gut,2006；55(3):374-9.

7Bonecchi R,Bianchi G,Bordignon PP,etal.Differential expression of chemokine receotors and chemotactic responsiveness of type I T helper cells(Th1s) and Th2s〔J〕.J Exp Med,1998；87(1):129-34.

8Chuang YH,Lian ZX,Cheng CM,etal.Increased levels of chemokine receptor CXCR3 and chemokines IP-10 and MIG in patients with primary biliary cirrhosis and their first degree relatives〔J〕.J Autoimmune，2005；25:126-32.

9Chen SC,de Groot M,Kinsley D,etal.Expression of chemokine receptor CXCR3 by lymphocytes and plasmacytoid lesions〔J〕.Arch Dermatol Res,2012；302(2):113-23.

10Henneken M,Dorner T,Burmester GR,etal.Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood B cells from patients with rheumatoid arthritis and systemic lypus erythematosus〔J〕.Arthritis Res Ther,2005；7:R1001-13.

11Wenzel J,Proelss J,Wiechert A,etal.CXCR3-mediated recruitment of cytotoxic lymphocytes in lupus erythematosus profundus〔J〕.J Am Acad Dermatol,2007；56:648-50.

〔2014-05-12修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)