褪黑素对糖尿病大鼠心肌热休克蛋白70表达的影响

褪黑素对糖尿病大鼠心肌热休克蛋白70表达的影响

韩雪1孟德欣孙权华锋2王瑶2李若男3王亮4齐亚灵

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究褪黑素对糖尿病大鼠心肌组织热休克蛋白(HSP)70表达的影响及其作用机制。方法高脂高糖饮食配合中等剂量链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型，高剂量(20 mg/kg体重)和低剂量(10 mg/kg体重)褪黑素灌胃16 w，测量心脏重量，计算心脏指数；HE染色观察心肌组织形态；免疫荧光检测心肌HSP70含量。结果褪黑素对糖尿病大鼠体质量、心脏指数和血糖值的变化无影响。褪黑素可以下调HSP70在心肌的表达，改善心肌功能。结论褪黑素可以下调HSP70在糖尿病大鼠心肌的表达，对糖尿病大鼠心肌起保护作用。

关键词〔〕褪黑素；糖尿病；心肌；热休克蛋白(HSP)70

中图分类号〔〕R589.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：佳木斯大学研究生科技创新项目(No.LZR2014_003)

通讯作者：齐亚灵(1967-)，女，医学博士，教授，博士生导师，主要从事基因诊断及生物治疗研究。

1保山中医药高等专科学校

2佳木斯大学2012级临床医学专业

3佳木斯大学2010级预防医学专业

4佳木斯大学2011级临床医学专业

孟德欣(1973-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事糖尿病研究。

第一作者：韩雪(1982-)，女，在读硕士，讲师，主要从事糖尿病研究。

目前全世界糖尿病患者已经超过2亿，而我国糖尿病患者也超过7 000万〔1〕。糖尿病心肌病(DCM)是最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期心脏功能障碍的一种疾病状态〔2〕。褪黑素(MT)是松果体分泌的激素之一，除具有调节睡眠、生殖及昼夜节律等生理功能外，还具有抗氧化活性，是一种高效自由基清除剂。本研究拟观察褪黑素对糖尿病大鼠心肌组织热休克蛋白(HSP)70表达的影响及其作用机制。

1材料与方法

1.1材料清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重160~180 g(长春亿斯实验动物技术有限责任公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；MT(浙江黄岩延年褪黑素有限公司)；HSP70多克隆抗体、FITC-羊抗兔、TRITC-IgG、山羊血清、DAPI染色液(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2模型的建立和分组大鼠适应性喂养1 w后，随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量MT组、高剂量MT组，每组15只。模型对照组、低剂量MT组、高剂量MT组用50 mg/kg体重STZ腹腔注射配合高脂高糖饮食造成糖尿病模型，正常对照组注射枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。造模后72 h尾静脉采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。造模后每天10：00~14：00灌胃一次，MT组用1%MT生理盐水悬浊液灌胃，低剂量MT组灌胃剂量为10 mg/kg体重，高剂量MT组灌胃剂量为20 mg/kg体重，正常对照组、模型对照组用等体积生理盐水灌胃，持续灌胃16 w。

1.3标本采集造模前后分别测大鼠空腹血糖，测量前禁食(不禁水)12 h，用爱先思血糖仪测量血糖值。每周测量大鼠体质量。实验结束时，每组部分大鼠沿心底大血管根部剪下心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干，精确称量心脏质量，计算心脏指数(=心脏质量/体质量)，称量后迅速将心脏放进-80℃冰箱冻存；其余大鼠在体剪开右心耳，左心室进针用50 ml注射器生理盐水200 ml左右冲洗，直至右心耳流出无色液体，用4%多聚甲醛溶液灌注，直至四肢强直，沿心底大血管根部剪下心脏，10%中性甲醛溶液浸泡。

1.4HE染色和免疫荧光检测将10%中性甲醛溶液固定的心肌组织制成5 μm厚石蜡切片，HE染色观察心肌形态变化；石蜡切片脱蜡至水后，甲醇-过氧化氢溶液10 min灭活内源性过氧化氢酶，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)微波加热抗原修复，山羊血清封闭37℃，20 min，一抗4℃过夜，二抗37℃，1 h，DAPI复染5 min，封片，激光共聚焦显微镜观察、拍摄。

1.5统计学方法应用SPSS14.0统计软件进行方差分析。

2结果

2.1一般状态、体质量和心脏指数正常对照组精神状态良好，体重持续稳定增长，皮毛顺滑洁白有光泽，无死亡；模型对照组精神萎靡，随着实验进展出现三多(多饮、多食、多尿)现象，体重下降，皮毛参差不齐、无光泽；MT组状态与模型对照组相近。与正常对照组比较，模型对照组和MT组体质量明显下降(P<0.05)，心脏指数明显增高(P<0.05)，低剂量MT组和高剂量MT组与模型对照组相比较，体质量和心脏指数无统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2血糖变化与正常对照组比较，模型对照组和MT组血糖值升高显著(P<0.05)；与模型对照组比较，MT组血糖值无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1　各组大鼠体质量、心脏指数、空腹

与正常对照组比较：1)P<0.05

2.3对心肌形态、结构的影响正常对照组心肌间隙清晰可见，胶原纤维分布稀疏，着色淡，心肌细胞排列整齐，结构清晰，细胞核圆形或椭圆形，染色质分布均匀。模型对照组心肌排列紊乱，肿胀，结构不清，间质及血管纤维组织增多，心肌细胞体积明显增大，且大小不均，排列紊乱，胞质丰富，胞质颜色变浅，细胞核变为长杆状，排列紊乱，核膜皱缩，核固缩，个别呈双核，染色质边聚于核膜下呈颗粒状。MT组心肌间隙清晰，心肌细胞排列整齐，结构清晰，细胞核形态正常，染色质均匀，低剂量MT组较高剂量MT组明显。见图1。

2.4各组心肌HSP70蛋白表达免疫荧光灰度值比较与正常对照组(n=9,52.36±7.60)比较，模型组心肌HSP70蛋白含量(n=5，79.49±9.29)明显升高(P<0.05)，与模型对照组比较，MT组心肌HSP70蛋白含量明显降低(P<0.05)，低剂量MT和高剂量MT组(n=8,55.80±7.28;n=8,56.13±9.74)无显著差别 (P>0.05)，见图2。

图1　各组心肌组织病理变化(HE，×400)

蓝色示DAPI染色，红色示HSP70 图2　各组心肌HSP70蛋白表达(免疫荧光，×180)

3讨论

糖尿病患者体内的高血糖及高脂肪酸诱导了氧化应激，产生过量的活性氧簇(ROS)。包括氧化应激在内的应激反应能够启动热应激基因的表达，产生一组高度保守的HSP。其中HSP70在应激反应中具有敏感性，当进入应激状态时，机体通过对HSP70 mRNA的优先翻译和增强其稳定性等调控机制的变化以适应需要。本实验结果表明HSP70蛋白含量与DCM发病具有一定相关性。这可能和HSP70的功能有关，作为分子伴侣，HSP70家族在应激状态下帮助需要折叠的蛋白质正确折叠，加快正常蛋白质合成的恢复；在细胞保护方面，HSP70表达增加可缓解细胞所受伤害，增强机体对应激的抵抗力；同时，HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中也起重要作用〔3〕。

MT除具有调节睡眠、生殖及昼夜节律等生理功能外，还具有抗氧化活性，是一种高效自由基清除剂。其自由基清除能力是还原型谷胱甘肽的4倍，甘露醇的14倍〔4〕。本实验说明MT通过下调HSP70在心肌的表达途径改善心肌功能。

参考文献4

1翁建平.对糖尿病流行病学、循证医学及基础研究的探索〔J〕.中山大学学报(医学科学版)，2010；32(2)：166-71.

2Aneja A，Tang WH，Bansilal S，etal.Diabetic cardiomyopathy：insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options〔J〕.Am J Med，2008；121(9)：48-57.

3任宝波，王玉艳，王纯净，等.HSP70家族的分类及基因结构与功能〔J〕.动物医学进展，2005；26(1)：98-101.

4Tan DX，Chen LD，Poeggeler B，etal.Melatonin：a potent，endogenous hydroxyl radical scavenger〔J〕.Endocrinol J，1993；1(1)：57-60.

〔2014-03-11修回〕

(编辑苑云杰)