N-乙酰半胱氨酸对单侧肾积水大鼠造影剂肾损害的保护作用

N-乙酰半胱氨酸对单侧肾积水大鼠造影剂肾损害的保护作用

夏强刘春晓钟志勇1郑侠1

(南方医科大学珠江医院泌尿外科，广东广州510280)

摘要〔〕目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对单侧肾积水大鼠造影剂肾损害的保护作用。方法雄性SD大鼠64只，制备可复性完全性左侧输尿管梗阻动物模型，模型成熟后随机分为3组，NAC组，生理盐水(NS)组与模型对照组。3 d后NAC组和NS组大鼠注射造影剂，模型对照组注射等量生理盐水，注射药物1 d后，各组取半数大鼠处死取材检测肾脏形态学变化、血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾小管细胞凋亡率及肾组织Bcl-2 mRNA表达；剩余大鼠手术解除输尿管梗阻，3 w后处死，同样作上述项目检测。结果注射造影剂的NAC组和NS组用药后第1天，大鼠肾脏体积、肾实质厚度和重量差异显著(P<0.05)，血清NGAL均较模型对照组显著升高(P<0.05)，NAC组较NS组NGAL水平显著降低(P<0.05)，三组左肾小管细胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表达比较无显著性差异(P>0.05)；解除梗阻后3 w，各组NGAL水平较前均无显著性变化(P>0.05)；NAC组左肾小管细胞凋亡率及Bcl-2 mRNA表达均高于模型对照组，但低于NS组(P<0.05)。结论NAC对单侧肾积水大鼠造影剂引起的肾损害的具有一定的保护作用，可能是通过上调Bcl-2 mRNA表达抑制肾小管细胞凋亡来实现的。

关键词〔〕N-乙酰半胱氨酸；肾积水；造影剂；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；凋亡

中图分类号〔〕R981.1〔文献标识码〕A〔

通讯作者：刘春晓(1957-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事微创泌尿外科疾病研究。

1广东省医学动物实验中心比较医学实验室

第一作者：夏强(1971-)，男，主任医师，博士在读，主要从事微创泌尿外科疾病研究。

在肾脏功能正常的个体中，应用造影剂后，有相当比例者发生造影剂急性肾损害(CI-AKI)或造影剂肾病(CIN)〔1，2〕，对于综合肾功能减退者，发生比例更高〔3，4〕。单侧梗阻性肾积水可引起单侧肾功能减退〔5〕，而造影剂的应用更容易对功能受损的积水肾产生损害；国内外许多学者的研究已经证实，N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为抗氧化剂对冠脉造影和冠脉介入治疗过程中造影剂肾损害有显著的保护作用〔6，7〕，但它对于单侧输尿管完全梗阻时造影剂肾损害的影响未见报道。本研究探讨NAC对单侧肾积水大鼠造影剂肾损害的保护作用。

1材料与方法

1.1实验动物雄性SPF级SD大鼠64只，体重250～290 g(由广东省医学实验动物中心提供，0113875)。自由进食和饮水，颗粒饲料和饮用水为广东省医学实验动物中心提供。

1.2实验用品及药物DP70倒置荧光显微镜(OLYMPUS)；轮转切片机(德国LEICA公司，RM2135)，生物组织全自动脱水机(湖北孝感医用仪器有限公司 TS-12C)，生物组织包埋机(湖北孝感医用仪器有限公司，BM-VII)，生物组织全自动染色机(湖北孝感医用仪器有限公司，RS-18)，病理图像分析系统(日本奥林巴斯，BX41)。NAC(意大利赞邦集团Zanbon，H20090620)；碘海醇注射液(扬子江药业集团有限公司，H10970326)。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)测定试剂盒，TUNEL试剂盒(Roche公司，12156792910)，胰蛋白酶(博士德生物技术有限公司)；RT-PCR反转录试剂盒、Total RNA提取试剂盒(均购于TaKaRa公司)。

1.3模型制作及分组〔8〕64只大鼠适应性实验1 w，术前12 h禁食、不禁水；腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，腹部正中剃毛、消毒、切开，暴露左侧肾盂输尿管连接部(UPJ)。在UPJ下方1 cm处游离一段长约5 mm的输尿管，将长1.8 cm的硬膜外麻醉用塑料导管对折成V型，轻轻套卡在输尿管上，用1号丝线结扎V管两端令输尿管管腔夹闭，注意线结与末端之间仅保留1~2 mm的距离。假手术组只游离输尿管不夹闭。术后取右侧卧位，单笼饲养，肌注青霉素钠8×104U/只预防感染，连续3 d；同条件饲养3 w。造模3 w后，SPF级SD大鼠64只，备可复性完全性左侧输尿管梗阻大鼠模型，模型成熟后随机分为3组，NAC组24只，用NAC灌胃3 d(300 mg·kg-1·d-1)；生理盐水灌胃组(NS组)20只，用NS灌胃3 d；模型对照组20只，不灌胃，同条件饲养3 d。

1.4用药及检测建模3 d后，NAC组和NS组模型大鼠经尾静脉注射造影剂(3 000 mg/kg)，模型对照组不用造影剂，注射等量NS。注射药物1 d后，各组取半数大鼠麻醉下腹主动脉采血2 ml，4℃ 3 000 r/min离心10 min，取血清测定NGAL，采血后颈椎脱臼处死大鼠取双肾，检测肾脏的长、宽、高，计算肾脏体积，公式：体积=(长×宽×高)×0.523；肾脏沿背侧纵轴剖开放尽积水，吸水纸蘸干后称重；肾实质厚度(最厚和最薄平均值)，并采用Tunnel法检测肾脏组织的细胞凋亡。

1.5RT-PCR检测细胞Bcl-2 mRNA的表达Trizol试剂提取总RNA，然后反转录成cDNA。应用 Primer 5.0设计引物。Bcl-2上游引物：5′-CCCTGGCATCTTCTCCTTC-3′，下游引物5′-GGGTGACATCTCCCTGTTGA-3′；内参基因β-actin上游引物：5′-CCCTCTTTTGTGCCTTGATAGTTCG-3′，下游引物5′-GGAGTCCTTCTGACCCATAC-3′。PCR扩增后，取5 μl PCR产物在含溴乙啶的1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统照相，利用Gel Pro 4.0软件计算基因表达条带灰度值。被检测的目的基因mRNA的表达水平用A目的基因/A内参基因表示。

1.6解除梗阻剩余大鼠麻醉后再次开腹，暴露梗阻部位，找到V管，剪开结扎线，解除梗阻，缝合；术后均给予肌注青霉素钠8×104U/只，以预防感染，连续注射3 d。3 w后，执行上述处理及检测。

2结果

2.1大鼠肾脏体积、肾实质厚度和重量的变化NAC组和NS组在用药后第1天左肾体积均比右肾显著增大(P<0.05)，左肾实质厚度较右肾显著变薄(P<0.05)，提示复制模型成功；解除梗阻3 w后3组大鼠左肾体积和右肾比较已无显著差异(P>0.05)，与解除梗阻前比较明显缩小(P<0.05)，说明梗阻解除成功。见表1。

表1　大鼠肾脏体积和肾实质厚度变化 ± s)

与同组右肾比较：1)P<0.05

2.2造影剂对大鼠体内NGAL的影响NAC组和NS组用药后第1天及解除梗阻后3 w血清NGAL均较模型对照组显著升高(P<0.05)，NAC组较NS组NGAL水平显著降低(P<0.05)，同组前后比较无显著性变化(P>0.05)。见表2。

表2　造影剂对大鼠体内NGAL的影响

与模型对照组比较：1)P<0.05；与NS组比较：2)P<0.05

2.3造影剂对肾小管细胞凋亡的影响用药后第1天，3组左肾小管细胞凋亡率比较无显著性差异(P>0.05)；解除梗阻后3 w，NAC组左肾小管细胞凋亡率低于模型对照组及NS组(P<0.05)。见表3。

2.4造影剂对肾Bcl-2 mRNA表达的影响用药后第1天，3组左肾Bcl-2 mRNA表达比较无显著差异(P>0.05)；解除梗阻后3 w，NAC组左肾Bcl-2 mRNA表达高于模型对照组及NS组(P<0.05)，见表4，图1。

表3　造影剂对肾小管细胞凋亡率的影响 ± s)

与模型对照组比较：1)P<0.05，下表同

图1　造影剂对肾Bcl-2 mRNA表达的影响

组别n用药后第1天解除梗阻后3wNAC组121.262±0.1421.243±0.1451)NS组121.417±0.1511.087±0.1421)模型对照组101.372±0.1680.858±0.153

3讨论

分泌性尿路造影(IVU)是临床上泌尿外科梗阻性疾病最常用的检查项目之一，目前使用较广泛的造影剂是碘造影剂，使用造影剂时可能会产生一些不良反应〔9〕，据统计，造影剂是造成住院病人急性肾损伤(AKI)的主要原因，发生率报告不一〔10，11〕，在院内获得性AKI中位列第三〔12〕。碘造影剂引起的AKI的机制尚未完全阐明，而造影剂肾脏损伤的发生和严重程度与造影前肾功能损害程度相关〔3，4〕。而对于单侧尿路梗阻的个体，综合肾功能大多正常，但是梗阻侧的肾功能会存在不同程度的损害，肾小球滤过率下降〔13〕，此时输注造影剂，会在肾内蓄积而引起损害。

NGAL蛋白是一新型蛋白，在AKI早期尿液和血清中即可检测到，对因对比剂引起的肾损伤具有肾脏保护作用，可作为急性肾损伤早期诊断的生物标记〔14，15〕。近年研究发现肾缺血性损伤后，NGAL蛋白在肾单位多处表达上调，以近端肾小管和细胞再生处最为明显，其机制可能是NGAL蛋白转运铁到近端肾小管细胞，在铁作用下血红素加氧酶-1表达上调，进而发挥保护作用。NGAL基因是缺血性肾损伤早期主要的诱导基因之一，在早期缺血性损伤的大鼠肾中证实NGAL mRNA表达增加和NGAL蛋白分泌增多，且NGAL蛋白的量与缺血程度、缺血持续时间呈正比。Bcl-2基因是一类抗细胞凋亡相关基因，其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。通过上调抗凋亡的Bcl-2的基因表达，从而在转录水平调节凋亡相关蛋白的表达以影响凋亡的发生。

目前认为可能有效的药物主要为NAC和抗坏血酸，NAC是一种抗氧化剂，已有不少研究采用NAC干预造影剂肾损伤过程〔16，17〕。本研究提示在同样单侧输尿管梗阻动物模型中，造影剂产生了明显的肾损伤，而且这种损伤在解除梗阻后并没有恢复趋势，推测单侧输尿管梗阻所致的肾功能下降加剧了造影剂的肾毒性，而NAC对单侧肾积水大鼠造影剂引起的肾损害的具有一定的保护作用，可能是通过上调Bcl-2 mRNA表达抑制肾小管细胞凋亡来实现的。

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〔2014-09-16修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)