非小细胞肺癌组织miR-34a的表达及其对H1299细胞增殖的影响

非小细胞肺癌组织miR-34a的表达及其对H1299细胞增殖的影响

严程陈晓品1周宪张素洁刘洋刘玉向廷秀2

(重庆医科大学肿瘤科，重庆400016)

摘要〔〕目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中miR-34a的表达情况及其对NSCLC细胞系H1299增殖的影响。方法RT-PCR方法检测miR-34a在NSCLC组织和NSCLC细胞系H1299中的表达情况。克隆形成实验及MTT增殖实验检测miR-34a对NSCLC 细胞系H1299增殖能力的影响；生物信息学方法预测miR-34a可能的功能性靶基因，并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的功能性靶基因。Western印迹检测miR-34a对预测靶基因表达的影响。结果相比正常组织而言，NSCLC组织和细胞系H1299中miR-34a表达均显著下降(P<0.05)；转染miR-34a可显著抑制NSCLC 细胞系H1299的增殖能力(P<0.05)，而转染miR-34a 抑制剂可增加NSCLC 细胞系H1299的增殖能力(P<0.05)。生物信息学预测显示Notch1是miR-34a可能的功能性靶基因，且得到荧光素报告实验结果证实。Western印迹结果显示转染miR-34a 可显著抑制NSCLC 细胞系H1299中Notch1的表达。结论miR-34a 可通过调节Notch1的表达，进而抑制NSCLC 细胞的增殖。

关键词〔〕非小细胞肺癌；miR-34a；增殖；Notch1

中图分类号〔〕R736〔文献标识码〕A〔

通讯作者：陈晓品(1954-)，男，教授，博士，主要从事恶性肿瘤放射治疗研究。

1重庆医科大学附属第一医院肿瘤科

2重庆医科大学附属第一医院实验研究中心

第一作者：严程(1980-)，男，硕士，主要从事肿瘤精确放疗研究。

非小细胞肺癌(NSCLC)的发生与多种微小RNA(miR)表达异常有关〔1〕。miR可在转录后水平对基因的表达进行负调控〔2〕，参与多种肿瘤的发生和发展，并在肿瘤细胞的转移和侵袭中具有重要作用〔3〕。miR-34a已证实与多种肿瘤的发生发展密切相关。在结直肠癌中，miR-34a可通过调节DNA甲基化而参与结直肠癌发生和发展〔4〕。在胃癌中，miR-34a可通过调节PI3K信号通路，进而抑制上皮生长因子受体(EGFR)信号，从而发挥胃癌抑制作用〔5〕。同时，miR-34a还证实与NSCLC的发生和发展密切相关〔6〕。然而，由于miR-34a下游靶基因众多，因此miR-34a调节NSCLC发生发展的机制还有待深入的研究。

1材料与方法

1.1临床资料收集2012年9月至2014年1月于我院进行NSCLC手术的NSCLC标本35例，标本取自原发肿瘤组织，同时收集上(下)切缘正常组织作为对照，正常组织均于术后病理证实无NSCLC组织侵犯。获取标本后迅速置于液氮中保存。所有患者术前均未接受化疗和放疗。患者年龄55～72〔平均(61.64±8.15)〕岁。

综上所述，NSCLC组织和NSCLC细胞系H1299中miR-34a的表达量显著降低，且 miR-34a可通过调节Notch1的表达而抑制NSCLC细胞系H1299的增殖，为miR-34a调节NSCLC进展机制提供了一种新的见解。

1.4噻唑蓝(MTT)增殖检测转染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的H1299细胞培养至对数生长期，接种于96孔培养板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，孵箱中放置4 h后吸出上清至ELISA板中，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，低速震荡10 min后，波长490 nm 处测定OD值。

1.3RT-PCRTrizol法提取NSCLC组织标本和H1299细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40个循环。引物序列：miR-34a上游引物：5’-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3’，下游引物：5’-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3’；内参照U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。得到的数据通过比较CT值法(2-△△Ct)进行定量分析。

1.2NSCLC细胞系H1299细胞购自上海拜力生物科技有限公司。细胞培养于含10%胎牛血清(BSA)的高糖DMEM培养基中。

1.5克隆形成实验转染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的A549细胞各5×103接种于6孔板中，培养72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0.1%结晶紫的20%甲醇染色30 min，计数形成的克隆数。

例如，在探索孟德尔分离定律过程中，教师已经具有“减数分裂和受精作用”的知识，但学生还不具备。这种认知结构的差异性，往往会使教师对分离定律的讲解高于学生的最近发展区，导致学生由于难以理解而一字不漏地记下孟德尔分离定律的假设。这时，一方面需要教师将认知结构还原至学生的水平(没有减数分裂的知识)，另一方面需要介绍孟德尔提出分离定律的时代背景(知识探索的开始)。将这两个方面作为教学起点，从学生的角度，引领学生一起探索孟德尔分离定律的发生与发展。

1.9统计学方法应用SPSS15.0统计软件进行分析，多组数据间比较采用Anova分析方法，两组数据间比较采用t检验。

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1.7细胞总蛋白提取实验用细胞以冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，400 r/min离心，5 min；弃去上清，细胞沉淀中加入蛋白酶抑制剂和适量的CytoBuster蛋白提取试剂，高速涡旋细胞裂解混合物25 s，室温放置15 min；4℃，12 000 r/min离心15 min；所得上清部分即细胞总蛋白，除留部分样品检测蛋白浓度外，其余分装15 μl/管，-80℃ 冻存。

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1.8Western印迹等量的提取蛋白经8%～10%十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离胶和5%浓缩胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，以含5% BSA的Tris盐酸缓冲液(TBST)室温封闭1 h，加入一抗4℃过夜孵育。第2天用0.1% TBST 洗膜3次，5 min/d，加入相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后，硝酸纤维素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。Actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.6靶基因预测及验证〔7〕通过TargetScans靶基因预测软件筛选出Notch1作为miR-34a的靶基因。采用荧光素酶报告方法验证靶基因。

2结果

3Lin Y，Wu J，Chen H，etal.Cyclin-dependent kinase 4 is a novel target in micoRNA-195-mediated cell cycle arrest in bladder cancer cells〔J〕.FEBS Lett，2012;586(4)：442-7.

2.2miR-34a对H1299细胞增殖的影响转染miR-34a可显著抑制H1299细胞的克隆形成能力(P<0.05)。而转染anti-miR-34a可显著增加H1299细胞的克隆形成能力(P<0.05)；此外，MTT增殖实验结果显示，转染miR-34a可显著抑制H1299细胞的增殖能力(P<0.05)，而转染anti-miR-34a可显著增加H1299细胞的增殖能力(P<0.05)。见图1，表1。

2.3miR-34a靶基因预测及验证TargetScans靶基因预测软件提示Notch1可能是miR-34a的靶基因，且为感兴趣的基因。miR-34a预测结合的Notch1 3’-UTR靶位点见图2。荧光素酶报告实验证实miR-34a与Notch1间存在直接的相互作用。

表1　miR-34a对H1299细胞增殖的影响

与NC组比较：1)P<0.05；与anti-miR-NC组比较：2)P<0.05

图1　miR-34a对H1299细胞增殖能力的影响

图2　TargetScans靶基因预测软件预测miR-34a靶基因

2.4miR-34a与Notch1表达相关性转染miR-34a可显著抑制H1299细胞中Notch1的表达(P<0.05)，而转染anti-miR-34a可显著增加H1299细胞中Notch1的表达(P<0.05)。见图3。

图3　Western印迹检测Notch1表达

3讨论

肺癌是恶性肿瘤中致死率最高的一种疾病，其中NSCLC的5年生存率仅为16%，且80%的肺癌均为NSCLC〔8〕。NSCLC的发生不仅与p53、Rb和Ras等蛋白质基因编码异常有关〔9〕，还与多种miR表达异常有关〔1〕。miRNA最早于1993 年由Lee 等在线虫体内发现，是一类约22 nt大小的非编码单链RNA分子。miRNA在许多生物过程，包括发育、分化、凋亡、代谢、免疫和肿瘤进展中均具有重要的作用。本研究进一步证实miR-34a与H1299细胞的增殖能力密切相关。提示miR-34a具有抑制NSCLC发生和发展的作用。该结果与文献报道结果一致〔6〕。

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每个miRNA可以调控多个靶基因，而每个基因的mRNA又可以受到多个miRNA的调节。miRNAs的功能主要由下游靶基因的生物学效应决定。本实验通过TargetScans靶基因预测软件筛选出miR-34a的靶基因，在众多靶基因中，因Notch1在人类癌症的进展中具有重要的作用，而成为感兴趣的靶基因。已知哺乳动物中表达有4种Notch受体及5种相关配体(Jagged-1，2，Delta-1，3，4)〔10〕。人类癌症中多存在Notch信号传导失调，同时，很多的研究表明Notch信号传导与癌症血管生成和转移密切相关〔11〕。对于结直肠癌的研究发现，Notch1的表达存在明显的升高，且与结直肠癌的增殖、分化和转移密切相关〔12〕。本研究提示，Notch1为miR-34a的功能性靶基因。

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4参考文献

1Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，etal.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004；101(9)：2999-3004.

2鲁艳明，银铎，王宁，等.miRNA-200c对卵巢癌细胞侵袭能力影响观察〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2014;21(10)：732-5.

2.1miR-34a在NSCLC组织和细胞系的表达较正常组织(1.02±0.16)相比，miR-34a在NSCLC组织的表达量(0.25±0.09)显著降低(P<0.05)；且miR-34a在NSCLC细胞系H1299中的表达量(0.33±0.14)亦显著降低(P<0.05)。

5Liu G，Jiang C，Li D，etal.MiRNA-34a inhibits EGFR-signaling-dependent MMP7 activation in gastric cancer〔J〕.Tumour Biol，2014;35(10)：9801-6.

自主学习课程：激发学生的学习兴趣，拓展学生的思维，培养学生的自学能力，以创造性地完成学习任务为目标，达到由“学会”到“会学”的目的。

4Ma ZB，Kong XL，Cui G，etal.Expression and clinical significance of miRNA-34a in colorectal cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2014;15(21)：9265-70.

6Chakraborty S，Mazumdar M，Mukherjee S，etal.Restoration of p53/miR-34a regulatory axis decreases survival advantage and ensures Bax-dependent apoptosis of non-small cell lung carcinoma cells〔J〕.FEBS Lett，2014;588(4)：549-59.

上述内容提到了智能真空开关装置，临时供电模式的相关工作人员需要不断学习，了解新技术和新技能，掌握最有效、最实用的临时供电模式，了解其运作原理和特点。

7Xu LF，Wu ZP，Chen Y，etal.MicroRNA-21 (miR-21) regulates cellular proliferation，invasion，migration，and apoptosis by targeting PTEN，RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma，Gejiu City，China〔J〕.PLoS One，2014;9(8)：e103698.

4.应有落地问题上的挑战。工信部信息中心此前发布的《2018年中国区块链产业白皮书》显示，截至2018年3月底，我国以区块链为主营业务的区块链公司数量已超过450家，中国区块链产业初步形成规模。但这其中大部分的项目无法落地。

8权琳，王毅，徐玲，等.非小细胞肺癌患者外周血循环内皮细胞表达的临床价值探讨〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版)，2014;34(9)：1228-31.

9Toyooka S，Mitsudomi T，Soh J，etal.Molecular oncology of lung cancer〔J〕.Gen Thorac Cardiovasc Surg，2011;59(8)：527-37.

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〔2015-03-25修回〕

(编辑袁左鸣)