没食子酸诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的机制

没食子酸诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的机制

罗强任鸿1孙黎郭春燕

(河北北方学院生命科学研究中心，河北张家口075000)

摘要〔〕目的体外观察没食子酸对人宫颈癌Hela生长及凋亡的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法体外培养Hela细胞，用不同浓度的没食子酸作用为实验组，同时设对照组，以CCK8法测细胞增殖抑制作用、流式细胞仪检测p53和Bcl-2蛋白表达情况，扫描电镜下观察细胞形态的改变。结果不同浓度没食子酸作用Hela细胞24 h增殖抑制显著(P<0.05)，其抑制效应具有剂量依赖性，同时诱导Hela细胞凋亡、上调p53基因表达、下调Bcl-2基因表达(P<0.05)。结论没食子酸可抑制Hela细胞的生长且随药物剂量的增加而升高，并可诱导肿瘤细胞凋亡，其抗肿瘤效应可能与细胞的基因调控有关。

关键词〔〕没食子酸；Hela； CCK-8； p53；Bcl-2；凋亡

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省教育厅资助项目(2007302)

1河北北方学院附属第一医院体检中心

第一作者：罗强(1977-)，男，实验师，主要从事细胞生物学及抗肿瘤机制研究。

没食子酸又名五倍子酸、棓酸,化学名3,4,5-三羟基苯甲酸(C7H6O5),为白色或淡黄色针状结晶或粉末,通常是以一水化合物的形式存在,是一种重要的有机原料,广泛用于化工、医药、食品、染料、轻工及电子等行业〔1〕。近年来研究发现没食子酸具备一定的抗病毒、抗真菌、抗肿瘤作用〔2〕,且毒性很低,可作为一种潜在的阻止肿瘤发生的化学预防剂〔3〕。但是,对没食子酸抗肿瘤效果仍有争议〔4〕。本研究观察没食子酸对人宫颈癌细胞增殖凋亡作用探讨其抗肿瘤效应。

1材料与方法

1.1 主要试剂和仪器人宫颈癌细胞株Hela由北京大学肿瘤防治研究所惠赠。RPMI1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司),CCK-8(上海同仁化学)，碘化丙啶(PI)深圳晶美生物工程有限公司产品；FITC-p53、PE-bcl-2(美国BD公司)。美国SpectraMax M2e 多功能微孔板检测系统,美国 FACSA ria流式细胞仪，日本HITACHI S-3400N扫描电镜。

1.2 Hela细胞培养细胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞用不同浓度没食子酸处理。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制取对数生长期的Hela细胞5×104/ml接种于96孔培养板,100 μl/孔。 用RPMI1640培养液将没食子酸稀释成7个不同浓度(0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L)，分别加入96孔培养板(100 μl/孔),每组设4个复孔，对照组加入等体积培养液，置37℃、5% CO2培养24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl继续培养4 h,之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板检测系统测吸光度(A490 nm值),按公式计算细胞抑制率；抑制率(%)=(1-实验组平均A490 nm值/对照组平均A490 nm值)×100%。

1.4 流式细胞仪检测p53，bcl-2蛋白表达取对数生长期Hela细胞(密度为1×106/ml)分别接种于4个50 ml的培养瓶中,贴壁后换不同浓度的没食子酸培养液(0.08、0.16、0.32 ng/L)， 对照组加入等量培养液，培养24 h后,收集细胞，分别加入20 μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min,上流式细胞仪检测。

1.5 扫描电镜观察将盖玻片高压处理后放于六孔板中，取对数生长期Hela细胞(密度为1×106/ml)分别接种到6孔板，使细胞贴附于盖玻片上，再用不同浓度的没食子酸作用，使用扫描电镜观察形态。

1.6 统计学处理采用SPSS11.0软件进行t检验。

2结果

2.1 没食子酸对Hela细胞增殖的影响CCK-8法检测0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L 7个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24 h，对Hela细胞的生长均得到明显的抑制，并且随着药物浓度增加，对Hela细胞抑制率增加且生存率下降。见表1。

表1　没食子酸对Hela细胞增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.05

2.2 没食子酸对Hela细胞p53和bcl-2表达的影响经0.16，0.32,0.64 mg/L 3个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24 h后，与对照组相比，p53表达明显增高，bcl-2表达显著降低，用药前后均有显著差异，且没食子酸对Hela细胞的作用呈剂量依赖性。见表2。

2.3 没食子酸对Hela细胞形态的影响经0.32,0.640 mg/L 2个不同浓度的没食子酸作用Hela细胞24 h后，与对照组相比，细胞形态出现明显变化，细胞间连接中断，外形皱缩，表面塌陷，形成凋亡小体，见图1。

图1　没食子酸对Hela细胞形态的影响(扫描电镜)

组别 p53 bcl-2 均值t值均值t值对照组1.68±0.10-3.49±0.11-0.16mg/L组3.51±0.13-26.8541)3.52±0.060.0570.32mg/L组7.92±0.07-52.0812)1.56±0.0940.7622)0.64mg/L组15.11±0.09-110.2492)0.79±0.0622.7252)

与对照组比较：1)P<0.05,与前浓度组比较：2)P<0.05

3讨论

没食子酸作为一种有机酸类,易被消化道所吸收,其作用机制已较明确,因其对肝脏、肾脏、心血管有较强的亲和力,生物学效应比较广泛〔5，6〕,没食子酸还具有抗氧化作用〔7，8〕。选择毒副作用低或无毒副作用的肿瘤药物治疗策略,是临床不断探索的难题〔9〕。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体,被其他细胞吞噬,并且在形态上有一定特征〔10，11〕。中药抗肿瘤作用的最重要机制之一是诱导肿瘤细胞的凋亡,从而抑制肿瘤的进一步恶化,乃至全部消灭残留的肿瘤细胞〔12〕。bcl-2 蛋白家族是细胞凋亡相关基因研究中研究得最多的一类蛋白质〔13〕。p53 基因对细胞凋亡的调控是研究得较多的〔14〕。p53 基因对防止细胞增生和保持DNA 受损基因组的完整性有重要作用〔15〕。应用转基因方法研究发现： 定位于内质网膜上的bcl-2 可能通过阻断钙离子 Ca2+从内质网向胞质中的流动,使依赖 Ca2+的核酸内切酶活性降低,从而阻断细胞凋亡〔16〕。有学者认为bcl-2 通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能〔17〕。p53 调 控 一 些 仅 有 BH3 区 域 的 蛋 白 ,作 为Bax/Bak的上游调控机制,诱导细胞凋亡〔18，19〕。流式细胞术结果表明没食子酸具有上调抑癌基因p53的表达，下调癌基因bcl-2的表达作用，而诱发Hela细胞凋亡。

4参考文献

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〔2013-12-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)