一种与核黄素合酶α亚基具有结构相似性的板蓝根多肽的分离纯化与表征

林 炜，楚秋平，王 茜，高观祯，周建武，2

(1．福州大学生物工程研究所，福建福州 350002;2．中国科学院上海生命科学研究院－浙江工商大学食品营养科学联合研究中心，浙江杭州 310035)

0 引言

板蓝根别名靛青根、蓝靛根、靛根，为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort．)的干燥根，是我国最常用的传统中药材，是清热解毒类中药的代表，广泛用于治疗多种疾病，如感冒发热、咽喉肿痛、流行性腮腺炎、扁桃体炎、丹毒、各种肝炎、乙型脑炎等［1－6］．近年来，板蓝根在现代临床上广泛应用于病毒性流感的预防与治疗．

核黄素合酶作为核黄素合成最后一步反应的关键酶，在很多细菌和酵母中都要依赖该酶形成内源核黄素，而动物和人类都缺少该酶，无法自身合成，只能从食物中获取，因此在人类和动物疾病检测和疫苗设计上，核黄素合酶作为一个很重要的靶标已经发挥了巨大的作用［7］．目前对核黄素合酶的研究主要集中在细菌和酵母等生物［8－9］，对植物中核黄素合酶的研究还很少，仅在少数几种植物上克隆了编码核黄素的基因，如菠菜、小麦、大麦、高粱、水稻等［10－13］，但这些基因的结构、性质及其功能还有待研究．

本研究对板蓝根水提物中的多肽组分进行了分离纯化，得到了一条相对分子质量约为7 ku的多肽组分，并对其基本生化性质和细胞毒性、抗病毒活性进行研究．通过数据比对，发现该多肽在结构上和核黄素合酶α亚基具有一定的同源性．

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

板蓝根鲜根(安徽阜阳太和县阮桥镇板蓝根GAP生产基地);中空纤维膜(截流相对分子质量为6 000 u);离子交换色谱SP－5PW(3．9 mm×300 mm，日本TOSOH公司);疏水色谱POROSHP2(4．6 mm×250 mm，美国POROS公司);低分子量蛋白标准样品(Amersham公司);高速冷冻离心机(Beckman公司);冷冻干燥机(ALPHA 1－2LD);DYY－5型恒压恒流电泳仪(北京市六一仪器厂);所用试剂均为分析纯．

1．2 方法

1．2．1 板蓝根鲜根蛋白粗提液的制备

称取板蓝根鲜根500 g，切片后冻于－80℃冰箱，直至硬脆后取出置于高速粉碎机充分粉碎，于1500 mL 0．01 mol·L－1、pH 7．2 的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4－NaH2PO4，含0．1 mol·L－1NaCl)中充分浸润，于4 ℃下搅拌浸提24 h，17 500 r·min－1、4℃下离心20 min，收集上清液，所得上清液即为板蓝根鲜根蛋白粗提液．

1．2．2 中空纤维膜超滤

板蓝根鲜根粗提液经过中空纤维膜超滤浓缩后，用0．02 mol·L－1、pH 4．0柠檬酸缓冲液透析，透析结束后，于17 500 r·min－1、4℃下离心20 min，所得上清液即为板蓝根鲜根蛋白粗提浓缩液．

1．2．3 阳离子交换色谱

用0．02 mol·L－1、pH 4．0柠檬酸缓冲液预先平衡SP－5PW强阳离子交换色谱柱，流动上样30 mL，0 ～0．15 mol·L－1NaCl、0．15 ～1 mol·L－1NaCl阶段梯度洗脱，流速1．0 mL·min－1，检测波长280 nm．

1．2．4 疏水色谱

用 0．02 mol·L－1、pH 6．0 的磷酸盐缓冲液(含1 mol·L－1(NH4)2SO4)预先平衡 POROS 20 HP2 疏水色谱柱，上样5 mL，1 ～0 mol·L－1(NH4)2SO4梯度洗脱，流速2．0 mL·min－1，检测波长280 nm．

1．2．5 RIP2 相对分子量测定

参考王旭等［14］的方法，浓缩胶浓度为4%，中间胶浓度为10%，分离胶浓度16．5%，以上浓度皆为体积质量．

1．2．6 RIP2 等电点测定

参照赵先亮等［15－16］的方法，采用垂直板等点聚焦的方法测定RIP2的等电点．

1．2．7 RIP2 N 端序列测定

多肽RIP2经过还原SDS－PAGE和电印迹后由福州大学生物工程研究所采用基于Edman降解法的测序仪进行N端氨基酸序列测定．

Edman降解法由偶联试剂PITC与多肽链自由N末端基团反应，生成苯氨基硫甲酰肽(PTC肽)．偶联反应在45～48℃进行约15 min并用过量的试剂使有机反应完全．用无水强酸如三氟乙酸(TFA)，使第一个残基环化，从而使该残基从剩余的肽链裂解出来，并成为2－苯胺基－噻唑啉酮衍生物(ATZ氨基酸)［17］．

1．2．8 RIP2 MDCK 细胞毒性

0．25%的胰酶将MDCK细胞消化后，用MEM培养基制成浓度为4×105cell·mL－1的细胞悬液．将制备好的MDCK细胞悬液接种于96孔板中(每孔200μL)置于37℃、5%(体积分数)CO2和95%湿度的培养条件下培养24 h后，弃培养液．96孔板用PBS清洗2次，于每孔内加入浓度分别为9、4．5、2．25、1．13、0．56、0．28 mg·mL－1的样品200μL，于37 ℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下孵育48 h，以每孔加细胞维持液200μL作为正常细胞对照组．取出孵育48 h的MDCK细胞，弃上清液，于每孔加入1 mg·mL－1的3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐(MTT)50μL，继续培养4 h后，再每孔加入150μL二甲基亚枫(DMSO)作用10 min，于570 nm波长下测量吸光值．

以下式计算细胞存活率S:其中:S为细胞存活率(%);A0为正常细胞对照组于570 nm测得的吸光度;A为实验样品于570 nm测得的吸光度．

1．2．9 RIP2抗流感病毒活性测定

在样品浓度范围内(0．28～9．00 mg·mL－1)，对RIP2样品进行连续2倍梯度稀释．在已形成单层细胞的96孔培养板中加入100TCID50病毒稀释液，每孔200μL，34℃吸附2 h后弃病毒液，用细胞PBS清洗2遍，加已稀释好的RIP2各浓度样品，每孔200μL，每浓度4孔，于34℃、5%CO2条件下培养48 h，以每孔加入200μL细胞维持液作为细胞阴性对照组．用MTT比色法于570 nm波长下测量吸光值，并计算其抗病毒活率．计算公式如下:

其中:A对照组为正常细胞阴性对照;A病毒组为阳性对照组．

2 结果与讨论

2．1 活性多肽的分离与纯化

板蓝根鲜根蛋白粗提浓缩液经阳离子交换阶段梯度洗脱时，如图1所示，洗脱得到四个吸光值较高的组分峰:SP1、SP2、SP3和SP4，分别收集穿透峰及SP1、SP2、SP3、SP4进行SDS－PAGE检测，如图2所示，穿透峰无蛋白条带，SP3和SP4各有一条浓度较高的蛋白条带，而RIP2在峰SP1中，将其与浓缩液电泳条带相比较，结果表明，粗提液经阳离子交换色谱分离后，目标多肽得到初步的分离．

图1 SP－5PW分离图谱Fig．1 Chromatogram of SP －5PW

图2 SP－5PW色谱SDS－PAGE图Fig．2 SDS－PAGE chromatogram of SP－5PW

峰SP1经过POROS HP2疏水色谱柱的分离共洗脱出两个峰，分别收集穿透峰、峰SP1HPP1和峰SP1HPP2，如图3所示．经SDS－PAGE鉴定，RIP2在峰SP1HPP2中，如图4所示．对峰SP1HPP2进行Tricine－SDS－PAGE鉴定，结果显示RIP2已经达到了电泳纯，如图5所示．

2．2 板蓝根蛋白的性质表征

2．2．1 RIP2 相对分子质量标定

RIP2经过Tricine－SDS－PAGE后，分别量出Tricine－SDS－PAGE电泳胶上标准蛋白、待测蛋白和染料距分离胶顶端的距离，计算出相对迁移率(即样品迁移距离/染料迁移距离)，以标准蛋白的分子质量的对数对它的相对迁移率作图，得到蛋白相对分子质量标准曲线．由该标准曲线可以计算出RIP2的相对分子质量为6．87 ku．

图3 POROSHP2分离图谱Fig．3 Chromatogram of POROSHP2

图4 POROSHP2色谱SDS－PAGE图Fig．4 SDS － PAGE chromatogram of POROSHP2

图5 RIP2－SDS－PAGE图Fig．5 SDS － PAGEof RIP2

2．2．2 RIP2 等电点测定

通过计算相对迁移率(即样品迁移距离/胶条总长)，可以计算出RIP2的等电点为7．73．RIP2等电点偏碱性，说明RIP2的碱性氨基酸含量较高，含有较多的自由氨基．

2．2．3 RIP2 N 端序列测定

对转膜至PVDF膜上的RIP2进行N端氨基酸序列的测定，测定了10个氨基酸残基，依次为QIGEFATAPF．通过NCBI蛋白数据库的检索，发现其与核黄素合酶α亚基具有同源性，序列比对结果如表1．核黄素合酶在植物生长发育、信号传导及抗病性上的作用仅在少数几种植物中进行了部分研究．如拟南芥的核黄素合酶可通过与生物激发子HpaGxoo作用从而发挥一定的抗病防卫作用［18］;而水稻核黄素合酶对植物的生长发育、活性氧的消除、抗病性以及细胞死亡都有非常重要的作用［12］．有研究表明核黄素分子中较长的D－核糖醇支链阻碍了异咯嗪平面环与DNA的嵌插作用，因而其主要作用方式是沟面作用和静电作用．通过这些作用核黄素可部分干扰DNA的模板作用，产生一定的抗肿瘤、抗病毒功能［19］．因此可推测该多肽对板蓝根自身生长及其抗病毒性具有一定影响．

表1 RIP2N同源性比对结果Tab．1 The homology comparision of RIP2N

2．2．4 RIP2抗流感病毒活性研究

板蓝根常用于治疗风热感冒等病症［20］，狗肾上皮细胞(Madin－Darby Canine Kidney cells，MDCK)是流感病毒的易感细胞株之一［21］，故MDCK细胞和流感病毒相互作用模型常用于中药抗流感病毒研究［22］．本实验利用MDCK细胞对板蓝根肽组分RIP2抗病毒作用进行研究．

RIP2抗流感病毒活性研究结果如图6所示．数据经SPSS软件分析，得F值为73．362，P值为0．000，小于0．01，说明数据表现为极显著．

如图6(a)所示，在9．00～0．56 mg·mL－1浓度内，RIP2对MDCK细胞表现出较大的毒性作用，其中在9．00 mg·mL－1时，对MDCK细胞的抑制作用达到35%;但是随着RIP2浓度的逐渐降低，其毒性也对应降低，直到一定浓度下不再表现出毒性(数据没有显示)．同时，对应浓度的RIP2样品对MDCK细胞抗流感病毒的治疗实验从图6(b)可知:RIP2浓度为4．50 mg·mL－1时，RIP2对MDCK细胞表现出较高的治疗效果，其治疗率可以达到35%，随着浓度的降低治疗效果逐步降低，直到0．56 mg·mL－1时，其治疗效果已不显著．其中RIP2浓度为9．00和0．28 mg·mL－1时，其对MDCK细胞不具有治疗效果，根据图6(a)可推测其为该浓度下RIP2本身对MDCK细胞的毒性作用大于治疗作用所致．

图6 RIP2对MDCK细胞毒性与治疗实验结果图(n=6)Fig．6 The result of RIP2 on MDCK cytotoxicity and therapeutic experiment(n=6)