不同浓度尿酸对培养人脐静脉内皮细胞功能的影响

不同浓度尿酸对培养人脐静脉内皮细胞功能的影响

王云开周金华

(南昌大学第一附属医院心血管内科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探讨尿酸对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能影响及可能机制分泌纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)蛋白的作用和可能的信号通路。方法分别用不同尿酸浓度〔蒸馏水(对照组)、119、238、476、952 μmol/L〕(n=6)干预体外培养的HUVECS 24 h，观察其形态、增殖、培养液中PAI-1蛋白的影响。观察476 μmol/L尿酸干预培养时，不同时间(1、3、6、12、24 h)对HUVECs培养液PAI-1蛋白及不同时间(15、30、60、120 min)细胞外信号调节激酶(ERK)1/2磷酸化水平的影响。用ERK1/2通路阻滞剂(PD98059，20 μmol/L)阻断尿酸诱导HUVECS分泌PAI-1蛋白。结果与对照组比较，浓度476、952 μmol/L尿酸使细胞增殖减少，培养液中PAI-1蛋白增加(P<0.05)。浓度为476 μmol/L尿酸作用HUVECs不同时间(1、3、6、12、24 h)对PAI-1蛋白的影响呈时间依赖性。不同时间(15、30、60、120 min)促ERK1/2磷酸化水平升高，与0 min组比较(P<0.05)。预先给予PD98059(20 μmol/L)作用后，尿酸476 μmol/L+ PD98059(20 μmol/L)能阻断PAI-1蛋白生成(P<0.05)。结论尿酸抑制HUVECs增生，增加PAI-1蛋白表达，同时增加ERK1/2磷酸化水平，ERK1/2通路阻滞剂PD98059部分抑制尿酸诱导HUVECS分泌PAI-1蛋白，尿酸通过ERK1/2信号通路诱导HUVECS分泌PAI-1蛋白。

关键词〔〕人脐静脉内皮细胞；细胞外信号通路1/2；纤溶酶原激活物抑制剂-1

中图分类号〔〕R322.1〔

第一作者：王云开(1963-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病及高血压研究。

血清尿酸浓度的升高与氧化应激、内皮功能障碍、血管平滑肌细胞增殖等有密切联系，认为高尿酸是心血管事件的一项独立危险因素〔1～3〕。正常浓度的尿酸在人体血浆中是重要的抗氧化剂，60%的尿酸具有清除自由基的功能。但尿酸浓度升高到一定程度，达到高尿酸血症水平时，尿酸的抗氧化能力则被氧化应激所掩盖，从而导致心血管事件的发生〔4〕。而另有一些研究认为〔5〕，心血管疾病往往伴随尿酸排泄减少及尿酸产生增加的因素，像肾小球滤过率的下降、高胰岛素血症、肾血管收缩、利尿剂的使用以及组织缺血、氧化应激等，因此认为高尿酸是心血管疾病产生的结果。研究表明，高尿酸与高血压、胰岛素抵抗、肥胖、高脂血症、糖耐量异常等因素协同作用〔6〕，加重动脉硬化，促进心脑血管疾病的发生。本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型，探讨尿酸是否激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径，使细胞外信号调节激酶(ERK)ERK1/2磷酸化，继而诱导人脐静脉内皮细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1。

1材料与方法

1.1主要试剂尿酸,PD98059,p-ERK1/2-抗(Santa Cruz公司，美国)；SuperECL Plus超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司，中国)；PAI-1 ELISA试剂盒(上海太阳生物技术公司，中国)；HUVECs(南京凯基生物公司，中国)；总蛋白提取试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所，中国)。

1.2方法

1.2.1HUVECs的体外培养HUVECs复苏,传代培养,HUVECs的计数处理，按白细胞计数法，计数4个角的4个大方格的细胞总数，细胞浓度(细胞数/ml)=4个大方格内的活细胞/4×104×稀释倍数。

1.2.2细胞增殖的测定接种培养96孔培养板每孔中加入细胞悬液100 μl，密度为1×105/ml置于37℃、5%二氧化碳的孵箱内培养24 h后，将不同浓度的尿酸(119、238、476、952 μmol/L)分别加入长成良好的单层细胞中，每种浓度设6个复孔，对照组(蒸馏水)各6孔，使每孔最终体积为200 μl。MTT法于各孔内加入5 mg/ml MTT液0.02 ml，再培养4 h。在酶联免疫检测仪上测定490 nm波长处的吸光度值。

1.2.3PAI-1蛋白水平的测定将生长良好的HUVES密度调整为3×104个/ml,接种于24孔培养板中,37℃ 5%二氧化碳孵箱中培养,当达到80%的细胞呈汇合状态,换用无血清培养基同步24 h。

1.2.4实验分组①不同浓度尿酸作用24 h对HUVECs培养液中PAI-1的影响：对照组(蒸馏水)、尿酸(119、238、476、952 μmol/L)组。②尿酸476 μmol/L组作用不同时间(1、3、6、12、24 h)对HUVECs培养液中PAI-1的影响。③PD98059对尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影响。PD98059预处理1 h后再加尿酸476 μmol/L,每组设为4个复孔,取上清液，-20℃保存备用。

1.2.5ELISA检测PAI-1蛋白含量按试剂盒进行实验:①试剂重建,②加样,③洗涤,④加酶标抗体,⑤洗涤,⑥显色,⑦终止,⑧比色。数据处理：以A490对PAI-1标准品(ng/ml)在双对数坐标系上作标准曲线，待测样品PAI-1含量(ng/ml)可从标准曲线上查出其浓度。

1.2.6ERK1/2磷酸化水平的影响取第三代HUVECs，按照上述方法，以2×105/孔接种于6孔培养板中，用不含血清的RPMI-1640液培养以调节细胞生长的同步，24 h后去上清，并记为0时刻，按照试验分组，改用尿酸476 μmol/L培养细胞120 min，分别在0、15、30、60、120 min收集细胞样本。

1.2.6.1蛋白含量测定①制作标准曲线：按说明书配制。②检测样品蛋白含量。

1.2.6.2测定细胞t-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达①对齐玻璃板，夹紧，短面朝外，垂直卡在架子上。②配制10%分离胶10 ml三蒸水3.95 ml；30 % 丙烯酰胺 3.3 ml；1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 ml。③混匀。④配置5%浓缩胶5 ml；三蒸水3.4 ml；30 % 丙烯酰胺0.83 ml；1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.63 ml。⑤混匀。⑥用流水冲洗浓缩胶。⑦上样。⑧电泳。⑨转膜。⑩膜的封闭和抗体孵育。结果检测：以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用Bandscan分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。Western印迹结束后进行剥脱实验，然后用相应的total ERK抗体进行检测。X-ray膜扫描。对于每个样品，用p-ERK条带的强度除以t-ERK条带的强度。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析及q检验。

2结果

2.1倒置显微镜HUVECs形态学观察接种于96孔板，至细胞生长贴壁，对照组HUVECs形态为薄椭圆形、多角形或长多角形,形态不一,胞质丰富且清轮廓清晰,细胞融合成单层,贴壁生长,形成典型的“铺路石样”结构。尿酸诱导后HUVECs形态:尿酸(119、238 μmol/L)作用24 h细胞形态基本正常，对照组无明显差别，随着浓度的增加,细胞损伤程度逐渐加重，尿酸476 μmol/L作用24 h后细胞稍被拉长,细胞形态较规则，稍皱缩。尿酸952 μmol/L作用24 h后出现明显的形态变化,细胞明显拉长，皱缩明显,细胞间隙增大。见图1。

图1　各组培养的HUVECs 24 h镜下形态(×100)

2.2不同浓度尿酸作用HUVECs 24 h对细胞增殖影响尿酸(119、238 μmol/L)组(0.679±0.016、0.670±0.028)与对照组(0.689±0.015)相比,对内皮细胞增殖的影响不明显。尿酸(476、952 μmol/L)组(0.584±0.021、0.540±0.020)与对照组相比,细胞增殖随浓度增加而减少(P<0.05)。

2.3不同浓度尿酸作用HUVECS 24 h对培养液中PAI-1蛋白的影响ELISA结果：对照组能诱导HUVECS分泌PAI-1(26.26±3.43)ng/ml，分别与尿酸(119、238 μmol/L)组(30.29±4.41、34.33±1.04)ng/ml比较,差异无统计学意义(P>0.05)，分别与尿酸(476、952 μmol/L)组(67.83±6.35、77.4±10.36)ng/ml比较,PAI-1蛋白差异均有统计学意义(P<0.05)。尿酸952 μmol/L组PAI-1蛋白分泌达高峰,与尿酸476 μmol/L组比较，PAI-1蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05)。尿酸诱导HUVECS分泌PAI-1蛋白的量随浓度的增加而增加,呈浓度依赖性。

2.4尿酸(476 μmol/L)组作用HUVECs不同时间对培养液中PAI-1蛋白的影响ELISA结果：随尿酸作用时间的延长，PAI-1蛋白分泌量亦增加,呈时间依赖性。6、12、24 h(9.95±0.13、26.47±3.35、84.90±8.74)ng/ml分别与1 h(1.39±0.01)ng/ml PAI-1蛋白比较，均有统计学意义(P<0.05)。

2.5尿酸对HUVECs ERK1/2磷酸化水平的影响Western印迹结果显示，HUVECs同时表达ERK蛋白的2种亚型，即ERK1和ERK2，分子量分别为42和44 kD。对照组p-ERK1/2蛋白表达活性很低，与尿酸476 μmol/L刺激HUVECS不同时间段比较，总ERK1/2蛋白没有变化，但p-ERK1/2蛋白表达明显增高，尿酸作用30 min组p-ERK1/2表达条带增强最明显，与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.6PD98059对尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影响ELISA结果显示，对照组PAI-1蛋白表达很低(26.26±3.43)。尿酸476 μmol/L组较对照组明显增多(67.83±6.35,P<0.05)；预先给予ERK1/2通路阻滞剂PD98059(20 μmol/L)作用后，与尿酸组476 μmol/L 比较，阻断尿酸诱导的PAI-1蛋白生成差异有统计学意义(50.04±4.34,P<0.05)。

p-ERK1/2：(both bands)细胞外信号调节酶1/2 Western印迹条带；t-ERK1/2:(total)细胞外信号调节酶1/2 Western印迹条带 图2　尿酸476 μmol/L作用HUVECs 不同时间对ERK1/2磷酸化水平的影响(n=3)

3讨论

本实验说明高浓度的尿酸对HUVECs有损害作用。组织型纤溶酶原激活物(t-PA) 和尿激酶纤溶酶原激活剂(u-PA)是纤溶激活系统的主要激活剂，使纤溶酶原变成纤溶酶，而纤溶酶的形成的调节主要通过PAI-1，PAI-1是t-PA和u-PA生理性抑制剂〔7〕。也有研究发现一些细胞因子通过ERK1/2通路诱导人平滑肌内皮细胞〔8〕、鼠肾小球膜细胞〔9〕分泌PAI-1。

在冠状动脉循环中，t-PA和u-PA与血栓调节素结合起主要的内源性防止血栓形成作用，因此，PAI-1的增加有可能增加冠状动脉血栓形成的危险，有实验和流行病学数据支持PAI-1导致缺血性心血管疾病的发展〔10〕，在年轻的急性心肌梗死生存者中测定PAI-1明显增加，在心梗生存者中血浆PAI-1活性亦增加，导致再发心肌梗死，在中年男女中，PAI-1抗原与活性增加了心梗的风险〔11〕，且独立于其他传统的危险因素，低血浆纤溶活性反映了PAI-1活性的增加，有可能增加年轻男性患缺血性心脏病的风险〔12〕。也有实验证据支持这些流行病学数据，使用转基因小鼠产生稳定型人类PAI-1过表达，发展成冠状动脉血栓形成和心肌梗死〔13〕。

本实验发现尿酸呈时间及浓度依赖性的诱导HUVECs PAI-1分泌。MAPK信号转导通路是尿酸的重要信号通路之一。PD98059可以有效地减弱尿酸对PAI-1蛋白合成的促进作用，说明ERK通路是PAI-1合成的上游调节因素，参与尿酸上调PAI-1表达的机制。本文发现ERK1/2通路拮抗剂PD98059不能完全阻断尿酸促进PAI-1的合成作用，其原因可能是任何一条信号通路的作用都不是独立的，胞内各信号之间相互协同、相互制约的关系对完成刺激的传递过程十分重要。尿酸可能同时激活了细胞内(包括P38、PI-3激酶通路等)的多条信号转导通路，而各信号通路之间普遍存在的信号串话现象，使得尿酸的刺激作用不能完全被PD98059阻断。

近年来尿酸与心血管疾病间的关系越来越受关注，目前公认的观点是高浓度的尿酸具有致心血管疾病的作用。本研究初步证实了尿酸通过ERK1/2途径诱导内皮细胞PAI-1合成，有助于更好地理解尿酸与冠心病之间的关系。

4参考文献

1Okura T，Higaki J，Kurata M，etal.Elevated serum uric acid is an independent predictor for cardiovascular events in patients with severe coronary artery stenosis：subanalysis of the Japanese Coronary Artery Disease (JCAD)Study〔J〕.Circ J,2009；73(5):885-91.

2Holme I，Aastveit AH,Hammar N，etal.Uric acid and risk of myocardial infarction，stroke and congestive heart failure in 417734 men and women in the Apolipoprotein Mortality Risk study(AMORIS)〔J〕.Intern Med,2009；266(6):558-70.

3Chen JH，Chuang SY，Chen HJ,etal.Serum uric acid level as an independent risk factor for all-cause，cardiovascular，and ischemic stroke mortality：a Chinese cohort study〔J〕.Arthritis Rheum,2009；61(2):225-32.

4Strazzullo P，Puig JG.Uric acid and oxidative stress：relative impact on cardiovascular risk〔J〕.Nutr Metab Cardiovasc Dis,2007；17(6):409-14.

5薛丽,张爱伦.高尿酸血症与心血管疾病研究进展〔J〕.医学综述,2006；12(2)：90-1.

6Chu NF，Wang DJ，Lion SH，etal.Relationship between hyperuricemia and other cardiovascular disease risk factors among adult males in Taiwan〔J〕.Eur J Epidemiol,2000；16(1):13.

7Fay WP.Plasminogen activator inhibitor-1,fibrin,and the vascular response to injury〔J〕.Trends Cardiovasc Med,2004；14:196-202.

8Demyanets S，Kaun C，Rychli K，etal.The inflammatory cytokine oncostatin M induces PAI-1 in human vascular smooth muscle cells in vitro via PI3-kinase and ERK1/2-dependent pathways〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007；293(3)：H1962-8.

9Guo B，Inoki K，Isono M，etal.MAPK/AP-1-dependent regulation of PAI-1 gene expression by TGF-beta in rat mesangial cells〔J〕.Kidney Int,2005；68(3):972-84.

10Kohler HP，Grant PJ.Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease〔J〕.N Engl J Med,2000；342:1792-801.

11Hamsten A，Wiman B，de Faire U，etal.Increased plasma levels of a rapid inhibitor of tissue plasminogen activator in young survivors of myocardial infarction〔J〕.N Engl J Med,1985；313:1557-63.

12Hamsten A，de Faire U，Walldius G，etal.Plasminogen activator inhibitor in plasma：risk factor for recurrent myocardial infarction〔J〕.Lancet,1987；2:3-9.

13Thogersen AM，Jansson JH，Boman K，etal.High plasminogen activator inhibitor and tissue plasminogen activator levels in plasma precede a first acute myocardial infarction in both men and women：evidence for the fibrinolytic system as an independent primary risk factor〔J〕.Circulation,1998；98:2241-7.

〔2013-10-29修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)