索拉菲尼联合紫杉醇对HepG2细胞的抑制作用及其对cyclinD1表达水平的影响

索拉菲尼联合紫杉醇对HepG2细胞的抑制作用及其对cyclinD1表达水平的影响

孙炜宋祥和卞勇华俞敏李玉华

(盐城卫生职业技术学院，江苏盐城224006)

摘要〔〕目的探讨索拉菲尼(SOR)单药、紫杉醇(PTX)单药以及两药联合对肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用及其对周期素依赖性蛋白cyclinD1表达的影响，探讨其协同作用机制。方法以不同浓度的SOR和不同浓度的PTX，分别组成单药组和联合用药组，另设不加药的对照组，作用于HepG2细胞。MTT法检测SOR、PTX单药及联用后HepG2细胞的增殖抑制率，流式细胞仪分析细胞的凋亡率；RT-PCR检测各组细胞中cyclinD1表达。结果SOR、PTX单药与联用均能抑制HepG2细胞增殖，且呈明显时间-剂量依赖效应，两药联用有协同效应，可使HepG2细胞增殖率明显下降，细胞数减少，联合组与对应的单药组间差异显著(P<0.05)；药物作用48 h后，给药组cyclinD1 mRNA的表达较对照组明显减少(P<0.05)，两药联用cyclinD1表达更显著，与单药组比较有显著差异(P<0.05)。结论SOR和PTX联用可协同下调HepG2细胞中cyclinD1表达，增强了抑制HepG2细胞增殖及诱导其凋亡效应。

关键词〔〕索拉菲尼；紫杉醇；cyclinD1；肝癌

中图分类号〔〕R735.7〔

基金项目：盐城市科技局科研项目(YK20113109)

通讯作者：李玉华(1963-)，男，教授，主要从事肿瘤分子机制研究。

第一作者：孙炜(1964-)，女，高级实验师，主要从事免疫分子机制研究。

原发性肝癌(PHC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、容易侵袭转移，死亡率高。因此，寻找一种合理有效的治疗方案具有重要的意义〔1〕。索拉非尼(SOR)是一种多激酶抑制剂，作为第1个在肝癌治疗中获得优势生存的靶向药物〔2〕，已被美国食品与药品管理局(FDA)确定用于肝癌患者的治疗。紫杉醇(PTX)是十分有效的抗肿瘤药，主要机制为该药能通过与微管蛋白相结合，阻止微管解聚，稳定已组装好的微管的结构和促进微管组装，致微管组装和平衡打乱。因此在组装过程中，紫杉醇的敏感性与周期蛋白依赖激酶(CDK)及其调节因子cyclinD1水平有关〔3，4〕。本研究探讨SOR联合PTX对人肝癌 HepG2细胞的抑制作用及其机制。

1材料与方法

1.1细胞与试剂索拉菲尼(SOR，德国拜耳公司)；用100%二甲基亚砜(DMSO，南京赛泓瑞生物科技有限公司)溶解，-20℃保存，实验时稀释，DMSO终浓度<0.5%。紫杉醇(PTX，江苏杨子江制药有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，美国 Sigma 公司)，用pH7.35 PBS配制成浓度为5 mg/ml。碘化丙啶(PI)试剂盒购自Sigma公司。人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2细胞培养HepG2细胞在37.5%CO2培养箱中培养，培养基为含10%新生牛血清的RPMI 1640，含1%双抗(青霉素和链霉素)，取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT法测定SOR、PTX单药组、SOR和PTX联合组对HepG2细胞的抑制率试验分组：无药细胞对照组；SOR组：20、12、6、3 μmol/L；PTX：30、20、10、5 μg/ml；联合组：SOR20 μmol/L+PTX30 μg/ml、SOR12 mol/L+PTX20 μg/ml、SOR6 mol/L+PTX10 μg/ml、SOR3 mol/L+PTX5 μg/ml，共分13组。取对数生长期的HepG2细胞，以7×103/孔密度接种于96孔板，每种浓度设4个复孔，每孔加200 μl，对照组加同量培养液，放入培养箱在5%CO2，37℃条件下培养24 h。加药后培养48 h，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h，吸去原培养液，离心将其紫色结晶沉淀于培养板底部，去上清。加入DMS0 150 μl/孔，振荡10 min，用酶标仪(波长490 nm)测定每个孔的OD值，计算细胞抑制率。

1.4流式细胞术检测细胞周期实验分组同MTT法，加药24 h后分别收集细胞，进行细胞周期及凋亡率检测。细胞周期检测：0.25%胰酶消化并收集细胞，3 000 r/min离心5 min 用8 ml PBS 制备单细胞悬液，加2 ml 75%预冷乙醇，吹打均匀，置4℃固定过夜，次日4℃3 000 r /min离心5 min，吸弃乙醇，用PBS重悬2次，加入PI染液500 L，4℃避光孵育20 min，上机检测，所得结果用细胞周期拟和软件ModFit分析；凋亡率检测：调整细胞浓度为5×105/ml，加入Annexin V-EGFP 5 L和5 L PI，避光室温反应15 min，上机检测。

1.5RT-PCR检测CyclinD1 mRNA取对数生长期细胞试验分组：无药细胞对照组；SOR(20 μmol/L)及PTX(30 μmol/L)单药组；SOR+ PTX联合组。0.25%的胰酶消化，台盼蓝染色计数后，用含10%的小牛血清，100 U ml青霉素和100 U ml 链霉素的 RMIP 1640 培养液制成细胞悬液，以5×104个/ml密度接种5 ml于培养瓶中，在37℃，5% CO2条件下培养；药物处理：24 h细胞贴壁后换 RMIP1640 培养液，加入500 L药物，在37℃，5% CO2条件下培养，细胞总RNA提取(TRIzol法)，进行反转录实验并鉴定总RNA浓度和纯度，进行PCR扩增所用引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)如下：上游引物：5'- GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA -3'，下游引物：5'- GCTGGAAACATGCCGGTTA -3'，扩增片段长度218 bp；β-actin内参照：上游引物： 5'- CTCGCGCTACTCTCTCTTTC -3'，下游引物 5'- CAGTCTCGATCC- CACTTAA -3'，扩增片段长度330 bp，退火温度：58℃，分别取10 μl PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(120 V电压)，紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统扫描拍照，将凝胶电泳图像输入美国Alpha9900凝胶分析系统，应用1-D Image Analysis Software进行表达强度分析。

1.6统计学方法采用SPSS11.5软件进行单因素方差分析和t检验。

2结果

2.1不同处理组对HepG2细胞增殖的抑制作用MTT法结果显示，SOR和PTX单药组、联合组能明显抑制人肝癌HepG2细胞的生长，呈明显量效关系。随给药浓度的提高，抑制率逐渐升高，随着药物浓度的增大,其对细胞的抑制作用逐渐增强，SOR和PTX单药组间无显著差别(P>0.05)，联合组与对应的单药组间差别显著(P<0.05)。见表1。

2.2流式细胞仪检测不同组细胞凋亡率SOR和PTX单药组及联合用药组与对照组相比均有显著差异(P<0.05)；联合组凋亡率最高，与SOR和PTX单药组比较具有显著差异(P<0.05)。见表1。

2.3RT-PCR检测不同组HepG2细胞中cyclinD1 mRNA的表达见图1。对照组，SOR组，PTX组和联合组中cyclinD1/β-actin mRNA的比值依次为(89.00±1.03)，(56.14±1.20)，(52.03±0.87)和(28.42±0.13)，SOR和PTX单药组、联合组与对照组及单药组与联合组相比均具有显著差异(P<0.05)。

表1　不同药物浓度组对HepG2细胞增殖

与相应浓度单药组比较：1)P<0.05

1～4：对照组、SOR组、PTX组及联合组 图1　不同药物组HepG2细胞中cyclinD1 mRNA表达

3讨论

cyclinD1是CDK激酶的调节因子，在细胞周期的G1/S期转化过程中作为正性调节因子调控细胞周期G1期细胞增殖的关键蛋白，cyclinD1作为G1期细胞周期素，通过对抑癌基因蛋白pRb的调控促使细胞越过G1/S限制点进入S期，cyclinD1于G1初期开始累积，于DNA合成前达峰值，S期含量最低。已证实其过度表达与多种肿瘤细胞的旺盛分裂有关，是被公认的原癌基因〔5〕。研究已发现该基因可在多种肿瘤中发生突变，扩增和过表达，促进肿瘤的发生和发展，cyclinD1过表达与肿瘤组织学类型、分化程度、淋巴转移状况密切相关，过表达cyclinD1的肿瘤患者预后较差〔6，7〕，其机制可能为肿瘤细胞过表达cyclinD1，导致细胞G1期缩短，提前进入S期，使细胞周期缩短，促进细胞增殖和细胞转化，导致细胞失控性生长，加速肿瘤的生长。

SOR是一种新型多靶点抗肿瘤药物〔8，9〕，能够抑制MAPK 信号传导系统及血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)受体而阻断肿瘤新生血管的形成，Raf激酶在大部分肝细胞癌中过度表达，并且Raf/ MEK/ERK 通路能被 HBV 、HCV 感染和有丝分裂生长因子所激活。Liu等〔10〕亦证实了SOR 能够抑制 PLC/PRF/5 和 HepG2 肝癌细胞株的Raf激酶活性，进而阻断MEK/ERK信号传导途径，并可降低细胞株的cyclinD1水平，从而抑制癌细胞增殖。此外，SOR也能通过抑制 Raf/MEK/ERK 信号传导通路降低elF4E的磷酸化水平下调bcl-2家族成员的抗凋亡蛋白MCL-1的表达，从而诱导肝癌细胞株凋亡。

PTX诱导肝癌细胞凋亡的分子机制不十分清楚，主要为PTX扰乱真核细胞质内微管系统。耿长新等〔11〕认为微管蛋白是PTX抗癌作用的靶点，微管在细胞分裂过程中形成纺锤体，对细胞的有丝分裂起重要作用。PTX选择性地与微管蛋白亚基N -末端第31位氨基酸结合，促进微管蛋白聚合成稳定的微管并且抑制微管解聚，破坏微管系统的正常平衡，扰乱细胞有丝分裂间期细胞形态、活动性、信号传导和细胞内物质转运的功能，导致细胞有丝分裂的阻滞，将增殖期的肿瘤细胞阻滞在G2-M期〔12〕；Chu等〔13〕的研究表明，PTX通过磷酸化抑制凋亡的bcl-2原癌基因，使其原本抑制凋亡的作用下降，破坏了促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡，从而使细胞发生凋亡；另有研究结果：PTX通过抑制硫氧还蛋白，低氧诱导因子-1α以及cyclinDl的表达降低HepG2的活性，抑制其生长，促进凋亡〔14〕。

本实验中发现SOR和PTX联用明显增强了HepG2细胞的抑制率和促进其凋亡的作用，RT-PCR检测两药联用后HepG2细胞中cyclinD1 mRNA明显下调。因此，两药联用协同作用机制可能如下：①可能协同作用抑制HepG2细胞中cyclinD1 mRNA表达，下调cyclinD1蛋白表达的信号通路，抑制cyclinD1蛋白的合成，阻滞细胞从G1期向S期分化〔5〕。②PTX促进微管蛋白聚合成稳定的微管并且抑制微管解聚，破坏微管系统的正常平衡，导致细胞有丝分裂的阻滞，将增殖期的肿瘤细胞进一步阻滞在G2-M期。③已有研究证实：PTX的耐药机制可能与抗凋亡蛋白bcl-2及bcl-XL的过度表达存在密切关系，它们能通过抑制线粒体凋亡通路最终阻断紫杉醇所诱导的细胞凋亡〔15〕。而SOR可以下调bcl-2家族成员的抗凋亡蛋白MCL-1的表达〔16〕，因此联用可能对拮抗PTX产生耐药性有一定的意义，这还有待于进一步的研究证实。

作为一种新的靶向性药物，SOR与化疗药物联用的多项Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验已在不同的实体肿瘤中展开〔17～19〕。本实验结果显示显示：SOR和PTX联用对肝癌细胞的抑制作用要大于单药治疗的效果。但要为临床应用提供更为确切的理论依据，SOR联用化疗药物治疗肿瘤的最佳方案仍需进行临床前的大量研究。

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〔2013-10-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)