喜树碱对番茄灰霉病菌的毒理效应

毛胜凤，周 湘，范闻春，张立钦，叶建仁

（1.南京林业大学 林学院 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安311300）

喜树碱对番茄灰霉病菌的毒理效应

毛胜凤1,2，周 湘2，范闻春2，张立钦2，叶建仁1

（1.南京林业大学 林学院 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安311300）

为探明喜树碱对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的毒理效应，应用生长速率法、电子显微镜观察研究不同质量浓度喜树碱对番茄灰霉病菌菌丝生长、细胞壁结构的影响；番茄Lycopersicon esculentum叶片经喜树碱处理后接种番茄灰霉病菌，观察药剂对病菌侵染活性的影响。结果表明：喜树碱为3.13 mg·L-1时就能强烈抑制番茄灰霉病菌菌丝生长，抑菌率达45.49%，差异显著（P＜0.05）；可显著影响番茄灰霉病菌对番茄活体叶片的侵染活性；喜树碱处理可导致菌体细胞壁表面出现破损、穿孔，细胞内含物外渗等现象。喜树碱能破坏菌丝体细胞结构，从而抑制番茄灰霉病菌的生长，而在活体叶片可显著影响病菌的侵染活性。图1表3参14

植物保护学；喜树碱；番茄灰霉病菌；毒理效应

番茄灰霉病Botrytis cinerea是番茄Lycopersicon esculentum生产的限制性障碍［1-2］。生产上主要依靠化学防治来控制灰霉病的危害，而长期、大量、单一地使用同种药剂已经对环境和人类健康带来很大的隐患，同时也引起番茄灰霉病菌产生抗药性［3］，因此，必须寻找一种既有效又安全的防治措施。目前，有近一半的新药物来自于天然产物［4］。喜树碱（camptothecin）是从喜树Camptotheca acuminata中提取出来的一种生物碱，1966年Wall等发现喜树果实提取物对小鼠肺癌Ad-755有一定的抑制作用，国内外掀起了对喜树碱的研究热潮，并对喜树碱的药理活性、临床应用及光照对喜树碱合成影响等方面进行了大量研究［5］，喜树碱系列衍生物抗癌药物是附加值极高的高技术产品［6］。已有报道：作为植物源农药的喜树叶乙醇提取物和水提物对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大肠埃希菌Escherichia coli，枯草杆菌 Bacillus subtilis，八叠球菌 Sarcina ventriculi有明显的抑制作用，喜树叶乙醇提取物对黑曲霉 Aspergillus niger，木霉Trichoderma virid和青霉Penicillium chrysogenum有的抗菌活性，但是水提物对霉菌没有抑制作用［7］。发现喜树乙醇提取物对黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum，小麦赤霉病菌Fusarium graminearum，番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等15种植物病原菌有抗菌活性［8］。张立钦等［9］以喜树碱为原药，进行农用杀菌剂的开发与研究。室内盆栽的活体实验研究结果表明：喜树碱对水稻纹枯病Rhizoctonia solani，黄瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea，黄瓜霜霉病Pseudoperonospora cubensis均有较高的杀菌活性，半数致死质量浓度分别为41.964， 40.495， 27.489 mg·L-1。同时，黄瓜霜霉病的田间药剂试验结果表明：喜树碱对霜霉病菌有杀菌活性，其半数致死质量浓度为11.221 mg·L-1，因此，喜树碱可能成为有效的生物源杀菌剂。然而截至目前，对于喜树碱是如何抑制植物病原菌的却知之甚少。本试验研究了喜树碱对番茄灰霉病菌的形态毒理，对菌体细胞壁和菌体生长发育的影响，以期为植物源农药的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea由浙江农林大学微生物实验室提供。药剂和主要仪器：喜树碱（camptothecin，简写CPT）（纯度≥95%）从湖北威得利化学科技有限公司购买。MLS-3750全自动高压蒸汽灭菌锅（日本SANYO），MfⅡ全自动菌落计数仪（中国杭州SHINESO）， HCP-2型临界干燥仪 （日本），IB-5型离子溅射仪（日本），XL30-ESEM型环境扫描电镜（荷兰飞利浦公司），Reichert超薄切片机（德国）。

供试植株：供试番茄品种为欧粉308 F1，采用基质育苗，待幼苗长至2～4片真叶时，选择长势一致的健康植株移栽到直径12.5 cm的塑料盆钵中，于温室中培养，待用。

溶液配制：准确称取喜树碱粉末0.2 g，加入到200 mL的锥形瓶中，然后往锥形瓶中加入50 mL的N,N-二甲基亚砜（DMSO），在40℃水浴锅中加热溶解，直到溶液完全澄清，即为4 000 mg·L-1的喜树碱溶液（母液）。放在4℃冰箱里保存备用。

1.2 方法

1.2.1 喜树碱对病菌的抑菌活性 菌种培养：供试番茄灰霉病菌接于装有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基直径为 9 cm的培皿中，于25℃恒温培养箱中倒置培养48 h后，备用。在超净工作台上，将喜树碱母液加入到灭菌后冷却至50～60℃的PDA培养基中，使喜树碱溶液与PDA培养基完全混匀，制得喜树碱的质量浓度梯度为200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13和 0 mg·L-1的含喜树碱的培养基，然后将制得的含喜树碱的培养基倒入灭过菌的培养皿中，15 mL·皿-1。待培养基凝固后，用6 mm的打孔器在长有番茄灰霉病菌菌落的培养基上打孔，用无菌镊子分别加到凝固的含药平板培养基表面的正中。接种时按7个质量浓度梯度和1个空白对照水来接种，重复接种3个·质量浓度-1。在25℃下恒温培养，每天定时测量菌落直径。按公式计算菌落抑菌率 （计算抑菌率时以水处理为对照）：菌落直径（mm）=菌落平均直径（mm）-5 mm（菌饼直径）。相对抑制率={［对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm）］/对照菌落直径（mm）}×100%。所得数据用DPS软件中的Duncan新复极差法进行方差分析和差异显著性检验（P=0.05），并计算半最大效应浓度（CEC50）的软件得到线形回归方程和CEC50的浓度。

1.2.2 喜树碱对病菌的形态毒理 将喜树碱配成所需的半最大效应浓度（CEC50），将剪好的适量的滤纸片分别放入稀释好的喜树碱溶液和无菌水中，浸泡0.5 h。将灭过菌的融化的培养基倒入已灭菌的培养皿中，15 mL·皿-1，共倒6个皿。待其凝固后，在其中3个皿中央加入喜树碱浸泡的滤纸片，然后将菌饼（直径5 mm）接种于滤纸片里面中央位置。另3个皿中加入无菌水浸泡的滤纸片，在中央接入上述的菌饼。于28℃下恒温培养48 h。取样及前处理［10］：取培养24，48，72 h的经过药液处理和未处理的对照番茄灰霉病菌，分别于菌丝边缘处（菌丝稀疏处）切约1.0 cm×1.0 cm大小的正方形小块（各2块）样品。将样品固定在质量分数为2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜；倒掉固定液，用0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，15 min·次-1；在质量分数1%的锇酸溶液中固定1～2 h；倒掉固定液，用0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次， 15 min·次-1；用梯度体积分数不同的乙醇（包括50%，70%，80%，90%，95%）溶液对样品进行脱水处理，处理15 min·体积分数-1，用体积分数为100%的乙醇处理2次， 20 min·次-1；用乙醇与醋酸异戊脂的混合液［V（乙醇）∶V（醋）=1∶1］处理样品30 min，再用纯醋酸异戊脂处理样品1～2 h。将处理好的样品进行干燥，将干燥好的样品镀膜，扫描电镜观察，得到图像后进行结果分析。

1.2.3 活体条件下喜树碱对番茄灰霉病菌的活性［11］保护作用的测定：用剪刀将生长旺盛的8～10叶期番茄植株相同部位叶片带叶柄快速剪下，将叶片在不同质量浓度的喜树碱药液中浸渍3～5 s后自然晾干，叶柄用脱脂棉包裹，置于9 cm培养皿中，对照以不含药剂的质量分数为0.1%的T-80无菌水处理。用直径6 mm的灭菌打孔器从25℃下培养4 d的番茄灰霉病菌菌落边缘打取菌饼，接种于叶片中脉处，置于25℃培养箱中培养，3 d后观察发病情况，十字交叉法测量叶片上的病斑直径。重复3次·质量浓度-1，叶片10片·处理-1。

1.2.4 数据处理 所得数据用DPS软件中的Duncan新复极差法进行方差分析和差异显著性检验（P= 0.05）。叶片法中，十字交叉测量叶片上的病斑直径，根据调查数据，计算防治效果。P（%）=［（D0-D1）/ D0］×100%。其中：P为防治效果；D0为空白对照病斑直径；D1为药剂处理病斑直径。

2 结果与分析

2.1 喜树碱对番茄灰霉菌病菌的毒力

离体测定结果表明：喜树碱对菌丝生长有抑制作用，其质量浓度反应曲线相关性较好。喜树碱带毒培养基培养番茄灰霉病菌，培养7 d后，测量各质量浓度的菌落直径并计算平均值和各质量浓度的抑制率（表1）。发现较低质量浓度的喜树碱就对番茄灰霉病菌的生长有抑制作用，质量浓度为6.25 mg·L-1时，抑制率达62%。喜树碱对番茄灰霉抑制的半最大效应浓度（CEC50）是3.503 1 mg·L-1。这比百菌清对番茄灰霉抑制CEC50（9.583 4 mg·L-1）小了近 3倍，跟福美双（CEC50为 4.480 3 mg·L-1）和退菌特（CEC50为 3.208 1 mg·L-1）［12］差不多。根据上表的结果，用计算标准曲线的软件得到标准曲线（表2）。

表1 不同质量浓度的喜树碱对番茄灰霉菌的抑制效果Table 1 Restraining effect of different concentration camptothecin on Botrytis cinerea

表2 喜树碱对番茄灰霉菌的毒力回归方程Table 2 Toxicity regression equation of camptothecin for Botrytis cinerea

2.2 喜树碱对番茄灰霉病菌的形态毒理影响

喜树碱处理的番茄灰霉病菌其菌落边缘的菌丝生长杂乱，生长速度减缓，如图1所示。对照组的未经喜树碱处理的番茄灰霉病菌生长良好，菌落边缘的菌丝纤细直长，粗细均匀一致，线条流畅；经喜树碱处理 24 h后的番茄灰霉病菌，菌落边缘的菌丝生长没有对照组那么均匀，菌丝生长速度变慢；处理48 h后，菌落边缘的菌丝部分出现塌陷现象，菌丝不再有明显的生长；处理 72 h后，菌落边缘的菌丝塌陷较多，菌落不再向外缘扩展。

喜树碱处理的番茄灰霉病菌菌丝出现了塌陷现象（图1下右）。未经喜树碱处理的番茄灰霉病菌，菌丝光滑而饱满，伸展良好（图1上左）；经喜树碱处理 24 h后的番茄灰霉病菌，菌丝表面粗糙（图1上右）；处理 48 h后，菌丝表面粗糙，并且部分出现了塌陷现象（图1下左）；处理 72 h后，菌丝基本上全部出现塌陷现象（图1下右）。

图1 喜树碱处理对番茄灰霉病菌菌丝形态的影响Figure 1 Effect of camptothecin treatment on mycelial shape of Botrytis cinerea

2.3 活体条件下喜树碱对番茄灰霉病菌的影响

从健康番茄植株相同部位上取下生长一致的叶片测定喜树碱的活性（表3）。经喜树碱处理后再接菌的番茄叶片上的病斑大小与对照存在显著差异，且不同喜树碱质量浓度处理间也存在显著差异。质量浓度为3.13 mg·L-1和6.25 mg·L-1时没有什么防治效果，叶片上的病斑随着质量浓度的增大有所减小，防治效果则随着质量浓度的增大有所提高。

3 结论与讨论

表3 活体条件下喜树碱对番茄灰霉病菌的活性Table 3 In vivo effects of camptothecin on Botrytis cinerea

本试验从离体和活体试验的变化上来研究喜树碱对番茄灰霉菌的毒理效应。发现喜树碱对番茄灰霉病菌的菌丝生长有抑制作用，质量浓度为3.13 mg·L-1时，抑制率有45.49%；喜树碱对番茄灰霉病菌菌丝形态有明显的影响，处理后的菌丝塌陷现象严重、生长点畸形和缢缩、内含物外渗现象明显。初步推测喜树碱处理番茄灰霉病菌后，引起细胞膜损伤及结构改变，接着出现细胞内含物外渗，最后导致菌丝体塌陷，直到停止生长。活体试验得出了相同的结论，即当叶片使用喜树碱处理，可对该病菌的侵染起到一定的控制作用。而在试验中发现离体的毒力效果要比活体试验时强，原因可能是离体培养时所有的培养条件比较一致，不存在寄主的影响，而在活体试验中增加了番茄植株为寄主，在喷施药剂后对病菌的影响就没有单一培养基上效果那么显著。若要作为农药开发，还要进行环境毒理研究和大田试验等进一步的探索。

在医学上研究得到：喜树碱的作用是使拓扑异构酶Ⅰ、喜树碱和DNA形成三元复合体，而使DNA在复制和转录过程发生断裂，最终导致细胞死亡［13］。喜树碱处理细胞导致短暂的细胞色素cyt c表达增加，活化呼吸链，引起细胞色素cyt c释放，激活胞质和线粒体中的caspase，导致线粒体发生内源性降解和膜电位的丧失，最终导致细胞凋亡［14］。我们研究发现：喜树碱处理后的菌丝内含物外渗随即出现菌丝塌陷现象，导致细胞坏死，但是喜树碱对于番茄灰霉病菌的作用位点是否就是在线粒体，是否会引起细胞色素cyt c表达量的变化，喜树碱的抑菌机理是否通过相同的方式作用还需要深入研究。

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Toxicological effects of camptothecin to Botrytis cinerea

MAO Shengfeng1,2,ZHOU Xiang2,FAN Wenchun2,ZHANG Liqin2,YE Jianren1
（1.Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China,College of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China;2.School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A& F University, Lin’an 311300,Zhejiang,China）

In order to ascertain the toxicology effects of camptothecin to Botrytis cinerea,growth rates were determined by the application of different concentrations of camptothecin inhibition of mycelial growth and cell well structure of B.cinerea.The results showed that camptothecin concentration 3.13 mg·L-1can strongly inhibit the mycelial growth,inhibition rate 45.49%antibacterial rate of significant differences.In the scanning electron microscope,camptothecin treated by B.cinerea,mycelial cells rupture,perforation,shriveled,growing point of collapse,cytoplasmic extravasation.In vivo effects of camptothecin on B.Cinerea showed that camptothecin against B.cinerea has a significant protective effect.［Ch,1 fig.3 tab.14 ref.］

plant protection;camptothecin;Botrytis cinerea;toxicological effects

S482.2

A

2095-0756（2015）04-0585-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.04.014

2015-01-04；

2015-03-04

浙江省自然科学基金资助项目（LY14C140005）；浙江农林大学大学生创新训练项目（201302021）

毛胜凤，高级实验师，从事森林保护与生物防治研究。E-mail：maosf@126.com。通信作者：叶建仁，教授，博士，从事森林保护与森林病理学研究。E-mail：jrye@njfu.com.cn