自制胱抑素C免疫诊断试剂的性能评价

张玉静

（上海复星长征医学科学有限公司 上海 200444）

自制胱抑素C免疫诊断试剂的性能评价

张玉静*

（上海复星长征医学科学有限公司 上海 200444）

目的：评价自主研发的胱抑素（Cyc）C免疫诊断试剂（终点法）在自动化检测血清中Cyc C浓度的性能。方法：采用奥林巴斯AU680全自动生化分析仪，经重复性、线性试验后，测定血清中Cyc C浓度，进行方法学评价及与美国Diazyme Cyc C试剂（终点法）比较。结果：试剂在两个水平质控下测定的变异系数（CV）分别为2.62%和1.79%，在0～8 mg/L浓度范围内，线性良好。两种试剂测定血清Cyc C浓度的相关系数较好，相关系数r=0.995。结论：自主研发的Cyc C试剂盒操作简便、快速、准确、稳定，安全性及有效性符合临床应用要求，可以满足大批量临床样本的常规和自动化分析，是一种值得推广的诊断试剂。

胱抑素C 胶乳增强免疫比浊法 诊断试剂 性能评价

胱抑素C（Cys C）是一种低分子量蛋白质，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的Cyc C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想内源性标志物[1]，而肾小球的滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是监测肾功能的一个重要指标，尤其对于肾移植的病人，快速准确地掌握肾小球滤过率的变化是十分重要的。此外由于Cyc C分子量大于肌酐，且带正电荷，所以它更容易反映肾小球滤过膜通透性的早期变化[2-4]，可以在肾小球滤过率轻微降低时升高，较肌酐更敏感，作为肾功能试验优于血清肌酐，由此可见Cyc C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物，具有重要的临床应用价值[5-7]。

血清中Cyc C浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。最早采用单向免疫扩散法（RID）及酶免疫测定法（EIA）对Cyc C含量进行测定，但它们不仅费时，且检测限也较差；较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定（RIA、FIA及EIA）的方法虽能改善Cyc C测定的可靠性，但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于临床急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法，很难自动化，因此限制了Cyc C含量测定在临床的广泛应用。报道的胶乳免疫均相测定方法，即在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，很容易用于自动化测定[8-9]。本研究使用胶乳增强免疫方法及自制试剂测定Cyc C浓度，试剂均相稳定，在普通实验室的生化仪上即可短时间内得到检测结果，且具有特异性强、灵敏度高等特点，在临床应用中实现了简单、快速、可靠检测，具有很高的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器

日本Olympus AU680全自动生化分析仪。

1.2 试剂、校准品和质控品

复星长征自主研发Cyc C试剂（简称复星长征试剂）为液体双试剂（R1和R2），R1主要成分为磷酸盐缓冲液；R2主要成分为偶联Cys C抗体的胶乳微球悬浊液；对照试剂、校准品、配套质控品1和配套质控品2均购自美国Diazyme公司。

1.3 样本

本研究的临床血清样本均从上海市某医院收集，静脉采血，样本新鲜无溶血、无黄疸。

1.4 测定方法及条件

按照以下参数来设置奥林巴斯AU680全自动生化分析仪：

速率法：温度37 ℃，主波长540 nm，副波长800 nm，吸光度范围0～2 A，比色杯光径1.0 cm，反应方向为吸光度上升的反应，样本用量5 μl，复星长征试剂和Diazyme试剂均为液体双试剂，分别由试剂1（R1）和试剂2（R2）组成。R1用量250 μl，孵育时间5 min；R2用量50 μl，平衡时间30 s，测定时间270 s，分析类型为2点终点法，校准模式为非线性6点定标。试剂线性范围：0～8 mg/L。

1.5 空白吸光度

用试剂（盒）测试纯水，记录试剂（盒）参数规定读数点540 nm下的吸光度值（A），重复三次。

1.6 重复性

在重复条件下，测试2个浓度分别为0.85和2.42 mg/L的质控品，将这两水平质控品分别测试10次，计算测量值的平均值（x—）、标准差（s）和变异系数（CV）。

1.7 线性试验

用接近线性范围下限的低值样品与接近线性范围上限的高值样品混合配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的6个样品（xi），分别用测试试剂（盒）对各样品进行测试，每个样品测试3次，分别求出每个浓度样品检测结果的均值（yi）。以6个浓度（xi）为自变量，以检测结果均值（yi）为因变量作线性回归。

1.8 复星长征试剂与Diazyme试剂的对比试验

随机选择67份样本，分别用复星长征试剂与Diazyme试剂对每份样本进行测定，取均值，按NCCLS EP9文件的评价方案统计结果[10]。

2 结果

2.1 空白吸光度

三次试剂空白的检测结果分别为0.506 7，0.507 8，0.510 4，试剂的空白变化差异的检测结果分别为0.001 6，0.000 5，0.002 1，表明试剂空白小于0.6，试剂的空白变化率小于0.005，检测结果符合复星长征公司的产品注册标准，试剂性能可控。

2.2 重复性

低、高两个水平质控品浓度的平均值分别为0.83 mg/L和2.41 mg/L，变异系数（CV）分别为2.62%和1.79%，均小于5%。试剂的重复性检测结果符合Cyc C的产品注册标准，试剂性能可控。

2.3 线性试验理论值(x)与测定值(Y)之间的线性回归

线性试验所得数据的线性回归方程为Y=0.994 6X-0.016，R=0.999 7，说明试剂在Cyc C浓度0.25～8.0 mg/L范围内线性关系良好。

2.4 复星长征试剂与Diazyme试剂的比对以及偏倚评估

复星长征试剂和Diazyme公司试剂对67例血清中Cyc C浓度测定的均值比较无显著差异（t=0.21，P＞0.05），所测Cyc C浓度具有良好的相关性（r=0.995，图1）。根据图1数据对比两方法测得的相对偏差的偏置情况，表明两种试剂检测同一样本的相对偏差结果良好，少数样本的相对偏差绝对值超过5%，但都集中在4 mg/L以上，可能是由于样本浓度较高、个体样本对不同试剂中抗体亲和性的微小差异、试剂以及仪器的系统偏差所致；另一方面，正常人的Cyc C浓度参考值仅为0.5～1.0 mg/L，而高于4 mg/L样本的相对偏差也在10%以内。对比后显示两种试剂测定单个样本偏差较小，分布较合理。

图1 两试剂测定血清样本中Cyc C浓度

3 讨论

国内外大量的研究结果表明，Cys C是评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。此外，近年来有研究结果显示，糖尿病肾损害是糖尿病严重的慢性微血管并发症，有超过30%的患者发展为肾功能衰竭及需要肾透析，杜国有，梁逸敏等[11-12]认为，与其他指标相比，Cys C检出糖尿病肾病的灵敏度较高，有必要在诊断为糖尿病而无肾病症状的患者中定期检测Cys C浓度变化，以便观察其与糖尿病微血管病的关系。所以Cys C不但是急性肾病早期的标志物，同时也与慢性肾脏疾病明显相关。

目前，Cys C的测定方法主要有免疫印迹法。酶联免疫法及化学发光法等，免疫印迹法操作复杂，精密度低；酶联免疫法受人为因素影响大、自动化程度不高；而化学发光法灵敏度虽高，但检测线性范围较小且成本高，需要特定仪器。然而，本研究所使用的胶乳增强免疫法克服了上述方法中绝大多数的不足之处，具有方法简便、快速、灵敏等优点，对仪器设备要求不高，可以在全自动生化仪上应用。

复星长征试剂可检测血清样本的Cys C浓度，与Diazyeme公司试剂所测值具有良好的线性相关性，其操作简单、线性范围宽、重复性好、灵敏度高、结果准确，完全可以替代美国Diazyme公司的Cyc C试剂应用于血清样本中Cyc C浓度的自动化测定，可满足医院对不同人群的Cys C浓度的检测需求。

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Evaluation of the performance of an independently developed Cys C immune diagnosis reagent

ZHANG Yujing*

(Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd., Shanghai 200444, China)

Objective:To evaluate the performance of an independently developed immune diagnosis reagent in the conventional and automatic determination of Cys C concentration in the clinical serum.Methods:The concentrations of Cys C were determined with Olympus AU680 automatic biochemical analyzer after testing the blank absorbance, repeatability and linearity. The evaluation of the reagent was carried out and the determination results were compared with those of the control reagent (Diazyme).Results:The coefficients of variation (CV) of Cys C concentrations at two levels of quality control were 2.62% and 1.79%. The results of determination showed a good linearity over the range of 0.25～8.0 mg/L. There was a good correlation between two reagents (r=0.995).Conclusion:The Cys C reagent made by our company can provide a simple, quick, accurate and stable method for the determination of Cys C concentrations in the clinical serum and meet the requirement of the conventional and automated analysis of mass clinical samples. This method may be worthy of promotion.

Cys C; latex-enhanced immunoturbidimetry; diagnosis reagent; performance evaluation

R981.2; R446.112

B

1006-1533(2015)21-0077-03

2015-07-08）

张玉静（1977-），女，工程师，注册经理，从事体外诊断试剂、生化试剂的研发与注册。E-mail: zhangyujing@fosunpharma.com