囊性纤维化疾病调节剂的研究进展

王新颖，刘冬青

（青岛科技大学，山东青岛266042）

囊性纤维化疾病调节剂的研究进展

王新颖，刘冬青

（青岛科技大学，山东青岛266042）

囊性纤维化是在白种人中最常见的危及生命的常染色体隐性遗传病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子基因突变引起，囊性纤维化跨膜传导调节因子也因此成为药物研发的靶点。按引发囊肿性纤维化的原因，可将囊肿性纤维化突变分为五类。本文主要介绍治疗前三类基因突变的调节剂，这些制剂为囊性纤维化患者带来了福音。

囊性纤维化；囊性纤维化跨膜传导调节因子；调节剂

1 介绍

1.1 CFTR突变的分类

囊性纤维化（CF）是由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病。CFTR可在转录、折叠、转运、降解、通道开放水平上影响蛋白质的生物合成与活性。CFTR氯离子和碳酸氢根离子电导活性的缺乏会降低上皮层顶端表面的水和pH，导致粘液积聚在胰腺、肠、睾丸、肝和肺中[1]。肺部感染和发炎是囊性纤维化发病和死亡的主要原因[2]。

在CFTR中存在超过1900种引发囊性纤维化的突变，我们将其分为五类[3]。Ⅰ类突变（CF患者中的10%）阻碍了CFTR蛋白的合成。Ⅱ类突变（CF患者中的70%）抑制了CFTR蛋白的折叠和稳定性，使其在内质网中降解，阻止了其转运到细胞表面。Ⅱ类突变的共同特征是Phe508的缺失造成的。Ⅲ类突变（CF患者中的2%～3%）是门控突变，正常转运到细胞表面但通道活性降低。Ⅳ类突变（＜2%）降低了通过蛋白通道的离子的电导率。Ⅴ类突变（＜1%）一般存在剪接缺陷，降低了CFTR蛋白的表达而没有改变氨基酸序列[4]。Ⅳ、Ⅴ类突变比前三类突变的临床症状要缓和[5]。

不同类型的突变有不同的治疗策略。促进识别终止密码子的化合物，可从mRNA合成功能CFTR，从而治疗一类突变。通过增强蛋白质转运到蛋白质表面的水平或直接作用于错误折叠的CFTR蛋白或改善蛋白质的折叠环境可治疗二类突变。通过改善蛋白表面的通道活性可治疗三类突变。这些化合物通常根据它们治疗主要蛋白缺陷的能力来分类，但这些制剂也可联合使用以增强疗效。

1.2 细胞分析

利用工程细胞系对化合物库进行高通量筛选来鉴别突变CFTR调节剂。这类细胞系已经成功用于鉴别校正剂和增效剂。这种细胞系通常被设计为表达CFTR的突变形式，特别是F508del。通过分析膜蛋白的改变或对卤化物敏感的荧光蛋白受体荧光淬灭的增强来测量依赖于F508delCFTR的离子电导率。

最近，从F508del和其它引起突变的患者体内分离得到了肠细胞组织体，并已经得到了一种不依赖突变CFTR外源表达的细胞体系，该体系对化合物库的筛选是一种有益的新方法。

CFTR突变的病理生理学后果在肺部最严重，肺细胞是评估表型解救的黄金标准。分离的原代人支气管上皮细胞(HBEs),在气-液界面处是分化的，气液界面处充分再现了其天然环境以至于在体外用分化良好的细胞可以观测到协调的纤毛跳动和黏液产量。在尤斯灌流室中用HBEs进行电生理学研究直接提供了内源性突变CFTR氯化物的电导活性的测量。

应用功能分析去得到构效关系再得到临床候选药物，说明了用表型筛选去发现药物的价值。

1.3 调整呼吸道表面液体缺陷的其他策略

这篇文章主要讨论利用小分子通过提高蛋白质表达、转运或增强它的开放来校正CFTR功能。虽然基因治疗能有效治疗任何CFTR突变，但用此方法需要克服人体的免疫防卫，这是一大挑战。在CF患者呼吸道内减少水分和严重的炎症已经成为治疗目标。一些有效治疗CF疾病的方法包括：通过抑制上皮细胞钠通道（ENaC）来阻断钠吸收（GS9411, GS5737，picolinamides）,通过离子载体刺激激活的氯化钙通道，通过P2Y2受体（denufosol）感应细胞内钙离子水平以及使用抗炎剂(BIIL 284 BS，CTX-4430)[6]。

2 治疗一类缺陷

2.1 Ataluren(PTC124，图1)

图1

Ataluren是一种通读制剂，可抑制PTCs，恢复功能蛋白生产[7,8]，但它的作用机制一直存在争议。Ataluren在一类突变的CF患者中进行测试，患者的一秒用力呼气容积（FEV1）提升了约3%。亚群分析显示，没有用氨基糖苷类抗生素治疗的患者的FEV1提升了6%[9]，目前Ataluren正在没有用氨基糖苷类抗生素治疗的患者中进行三期临床试验。

2.2 NB124(图2)

图2

NB124[10]是一类合成氨基糖苷类抗生素，通过去除调节抗菌作用的结构成分而保留促进PTCs通读的成分设计得到。对一类突变非常有效，比第一代化合物的治疗指数强10倍，与Ivacaftor(一种增效剂，Compound 12)联合使用可进一步增强其活性。

3 治疗二类缺陷（校正剂）

校正剂是帮助二类突变的CFTR克服折叠、稳定性、降解而到达细胞表面的化合物。最常见的CFTR突变是F508del突变。二类突变占所有CFTR突变的70%。调查显示，87%的CF患者至少有一个F508del，47%是纯合子，40%是F508del结合另一引起CF突变的杂合子。最近的研究提供了一些校正F508del折叠和转运的调节剂[11]。治疗策略包括用药理学分子伴侣直接修正F508delCFTR[12]，增强折叠环境，调整由于增强突变蛋白的表达和稳定性而造成的细胞压力。校正CFTR转运的化合物在其它蛋白质折叠/转运疾病中也显示出了疗效。

3.1 VX-809(图3)

图3

在原发性患者的F508del/F508del人支气管上皮细胞（HBEs）中，校正剂VX-809使氯离子流量提高到非CF患者HBEs的14%，Ivacaftor可达到9%，两者结合使用可达到25%。VX-809最可能是一种药物分子伴侣，稳定蛋白质突变体的NBD1域和第一个跨膜域(MSD1)的相互作用。

在临床试验中，纯合子的F508del患者，单独用单剂量的VX-809或Ivacaftor都不能显著提高FEV1，而两者联合使用可使FEV1提高2.8%～3.3%。

3.2 VX-661(图4）

VX-661是第二个F508delCFTR校正药物，目前正在进行临床Ⅱ期实验。它协助CFTR蛋白到达细胞表面，使F508delCFTR突变通道避免降解且转运到细胞膜上。在原发性患者的F508del/F508del HBEs中，校正剂VX-661使氯离子流量提高到非CF患者HBEs的9%，Ivacaftor也可达到9%，两者结合使用可达到26%。

3.3 407882(图5)

用DOCK程序对F508delNBD1进行基于结构的虚拟筛选，得到了新的F508del转运校正剂[13]。它干扰NBD1和角蛋白8的相互作用，1μM就可使F508delHBEs活性达到非CF患者HBE活性的15%。

图4

图5

3.4 Matrine(图6)

图6

分子伴侣质量控制通路的调节也是校正有缺陷的CFTR折叠的一种有效策略。研究发现，苦参碱（Matrine）[14]抑制分子伴侣Hsc70从ER释放F508del⁃CFTR到细胞表面，致使在细胞表面有比较高的F508del蛋白水平。

3.5 Apoptozole(图7)

图7

Apoptozole[15]结合Hsc70和Hsp70，解离常数分别为0.21μM和0.14μM。该化合物通过阻碍突变体与Hsc70分子伴侣和泛素化连接酶的相互作用来抑制F508delCFTR的泛素化，从而增强转运和细胞表面的稳定性。在F508del-CFTR表达的人类胚胎肾细胞（HEK）中，200nM的Apoptozole使氯离子通道活性达到野生型CFTR(wt-CFTR)表达细胞的20%。

3.6 Latonduine A(图8)

图8

通过筛选太平洋海洋海面提取物发现了可修正F508del错误折叠的校正剂Latonduines，使CFTR转运能力提高到wt-CFTR表面表达的45%[16]。

3.7 激酶抑制剂

在激酶抑制剂化合物库中筛选得到可以恢复F508delCFTR活性的化合物，研究显示，以FGFR/ FEGFR/PDGFR为靶点的激酶抑制剂SU5402,以及以Ras/Raf/MEK/ERK/p38,和GSK-3β为靶点的激酶抑制剂kenpaullone可使F508del恢复到wt-CFTR 的10%～30%。

3.8 其它校正剂

研究表明蛋白质稳态调节剂单独使用在HBEs中有活性，也可与其它校正剂联合使用来增强校正剂的疗效。四环素通过调节蛋白质稳态环境来发挥校正作用。Ambroxol可提高CF患者细胞内CFTR 和ENaC表达以及氯离子转运。

4 治疗三类缺陷（增效剂）

4.1 VX-770(图9)

Ivacaftor是第一个获批的治疗CF的制剂，他在2012年1月被批准治疗G551D突变的患者（占CF患者的4.3%）[17]。来自PERSIST的数据分析显示，用Ivacaftor进行了144周的持续治疗，其可在肺功能（FEV1提高了6%）、体重等方面持续发挥作用。

图9

4.2 RP193(图10)

图10

有研究报道，CDK/GSK-3β抑制剂RP193可校正F508del，它对野生型、F508del和G551D CFTR都有效。吡咯并[2,3-b]吡嗪系列化合物的构效关系表明，RP193使CFTR增强的同时有较低的毒性。

4.3 其他的增效剂

已经报道的其他的增效剂还有白藜芦醇、去氢木香内酯和Dihydropyridines。

5 有双重活性的化合物

为了充分优化F508delCFTR的功能活性，必须既校正转运缺陷，又增强在细胞表面的通道开放。为此可将校正剂与增效剂联合使用或者寻找有这两种活性的化合物。有研究已经发现了具有校正剂和增效剂双重活性的化合物，可在一次治疗中同时改善两种功能缺陷。此外，一些有抗炎活性的化合物也同时具有F508del CFTR校正剂和增效剂的活性。

5.1 N6022

研究表明，S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）抑制剂同时具有抗炎、CFTR校正剂和增效剂活性，它作用于Hsp70/Hsp90组织蛋白(Hop)通道而发挥作用。N6022是一种GSNOR抑制剂，IC50为8nM，已经被批准用于F508delCFTR患者[18]。

5.2 CoPo-22

氰基喹啉类化合物CoPo-22通过高通量筛选得到[19]。研究显示，此化合物既可只做校正剂或增效剂，也可同时具有这两种活性。分子建模显示在氰基喹啉和芳香酰胺间的柔性链和相对较短的连接是重要的CoPo特性。

5.3 Hyalout4(图11)

图11

CFTR不仅生成天然水化物也生成透明质酸。Hyalout4以二芳基类似物为基础，模仿透明质酸链的关键结构特点，从而增强了膜渗透性，既可用作F508delCFTR校正剂，也可用作增效剂[20]。

6 结论

治疗囊性纤维化能延长此病患者的寿命，改善患者的生活质量，如今，囊性纤维化患者的寿命已由28岁延长到了38岁。然而，从意识到CFTR基因缺陷到第一个制剂上市花费了28年。对由CFTR门控突变引发的三类说明了用小分子治疗CF的可能，但仍需要开发大量药物来治疗二类CF，Ivacaftor的上市说明了用小分子治疗CF的可能，但仍需要开发大量药物来治疗二类CF，探索多种校正多元缺陷的方法。这些策略的联合使用是治疗F508delCF的成功方法，有希望治愈所有的CF患者。

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·信息·

“皮塑废弃物粉体相容增强关键技术及其循环应用”荣获浙江省科技二等奖

在浙江省政府召开全省科学技术奖励大会上，浙江丰利粉碎设备有限公司和宁波工程学院合力研发的“皮塑废弃物粉体相容增强关键技术及其循环应用”项目荣获技术发明二等奖。该项目有效实现了皮塑废弃物粉碎装备产业化，皮粉增强橡胶制品生产以及回收塑料的再生资源化利用等，取得了良好的社会和生态效益。

浙江丰利携手宁波工程学院，从2007年开始产学研合作，合力攻关皮革废弃物资源化利用课题，共同承担的“皮革废弃物用作橡塑填充材料技术开发及产业化”项目列入浙江省2008年度第一批重大科技专项。为进一步推进这一工程，又于2009年8月1 8日成立了“废弃生物质资源化及装备工程技术中心”。2013年7月，该项目在宁波工程学院首次通过教育部科技成果鉴定。通过近10年的不懈努力，终于突破了粉碎装置和相容增强等关键技术，并实现了多项产品的循环应用。该项目共发表学术论文48篇，其中SCI/EI论文13篇；获得授权中国发明专利5件，授权实用新型专利5件，申请中国发明专利9件。该项成果在固体废弃物的循环利用方面获得了多项创新技术，在皮/塑废弃物综合利用及其复合材料技术领域达到国际先进水平。

项目实施以来，已在江浙沪等省市推广应用，有效减量消耗处理废塑料、废弃皮革等固废，使之变废为宝，促进循环经济发展，改善人们居住环境生态条件，保证环境生态文明，树立良好形象提供强有力的地支撑。

（吴红富）

10.3969/j.issn.1008-1267.2015.04.002

TQ463+.5

A

1008-1267（2015）04-0004-05

2015-03-18