高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶

2015-12-26许秀琴,杨挺,赵健等

安徽农业科学 2015年22期

许秀琴，杨挺，赵健，章豪，吴银良，王立君，朱勇

(宁波市农业科学研究院，浙江宁波 315040)

摘要研究建立了高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的方法。样品中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇提取，过WCX柱，LC-MS/MS进行分析。分析时采用Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.10%甲酸水-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正电子(ESI+)模式电离，多反应监测(MRM)模式检测，外标法进行定量。结果表明，盐酸可乐定和盐酸赛庚啶标准溶液在1.0～50.0 μg/L范围内，峰面积与含量呈线性相关。盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的检出限均为0.20 μg/kg，样品中添标回收率在85%～100%，相对标准偏差(RSD)小于10%。

关键词高效液相色谱-串联质谱；盐酸可乐定；盐酸赛赓啶；猪肉

中图分类号S851.34+7;TS251.7

基金项目宁波市农科教项目(2014NK36)。

作者简介许秀琴(1980- )，女，江苏东海人，工程师，博士，从事食品检测研究。

收稿日期2015-06-22

Determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in Swine Tissue by Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry

XU Xiu-qin,YANG Ting,ZHAO Jian et al (Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo,Zhejiang 315040)

AbstractA simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in swine tissue was developed.Samples were extracted with acidification of methanol by 0.1 mol/L HCl,through WCX column and analyzed by LC/MS-MS on a Waters Acquity BEH C18 column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution.Detection was carried out with an electrospray ionisation (ESI) probe and operated in the positive ion mode.Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride was quantified by the external standard method.There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L.The limits of detection for Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride were both 0.20 μg/kg.The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 100% and the relative standard deviations were lower than 10%.

Key words Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry; Clonidine hydrochloride; Cyproheptadine hydrochloride; Swine tissue

盐酸可乐定(Clonidine Hydrochloride,分子式为C9H9Cl2N3·HCl)和盐酸赛庚啶(Cyproheptadine hydrochloride,分子式为C21H21N·HCl)分别作为人类使用的抗高血压药物和抗组胺药[1]，分子结构式如图1、图2所示。盐酸可乐定主要用于治疗高血压、高血压急症、偏头痛、绝经期潮热、痛经以及戒绝阿片瘾毒症状，常见的不良反应有口干、昏睡、头晕、精神抑郁、便秘和镇静、性功能降低和夜尿多、瘙痒、恶心、呕吐、失眠、荨麻疹、血管神经性水肿和风疹、疲劳、直立性症状、紧张和焦躁、脱发、皮疹、厌食和全身不适、体重增加、头痛、乏力、戒断综合征、短暂肝功能异常等。盐酸赛庚啶主要用于治疗荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎、皮肤瘙痒、鼻炎、偏头痛、支气管哮喘等，主要不良反应有嗜睡、头昏、乏力等。将可乐定添加于饲料中，可以促进猪的生长，并提高瘦肉率[2-3]，赛庚啶也有一定的刺激食欲的功能[4]。因此，国内有发现畜产品养殖者将这2种药物添加于饲料中，这无疑会给人类的健康带来危害。北京怀柔就发生过可乐定的中毒事件[5]，造成34人出现头晕，昏迷并入院治疗。农业部于2010年12月27日发布1519号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。目前，对于盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定主要集中于医药领域[6-17]，陈其煌测定了猪尿和猪肝中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶[1,18]；柯光明等测定了家兔血液中的可乐定含量[19]，曹莹等[20-21]、李丹妮等[4]测定了饲料中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。对于猪肉中的可乐定及赛庚啶至今尚无人测定，笔者采用高效液相色谱-串联质谱法测定了猪肉中的可乐定和赛庚啶含量，检测限低准确度高，可以很好地用于猪肉样品中可乐定和赛庚啶的测定。

1材料与方法

1.1材料UPLC-XEVO超高效液相色谱质谱仪，美国Waters 公司；SIGMA3K15离心机，北京博励行有限公司；RT SPE全自动固相萃取仪，美国Caliper;Mili Q 超纯水仪，美国Millipore 公司。

盐酸可乐定标准品、盐酸赛庚啶标准品，中国药品生物制品检定所。固相萃取柱：Oasis®WCX 500 mg,3 ml；CleanertSCX 500 mg,3 ml；CNWBOND HC-C18200 mg,3 ml；Oasis®MCX 500 mg,3 ml；甲醇和乙腈(色谱纯)，美国默克公司；试验用水为Mili Q超纯水仪所制超纯水；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2标准溶液的配制

1.2.1标准储备液。称取盐酸可乐定、盐酸赛庚啶标准品10.0 mg定容至100 ml甲醇中，质量浓度为100 mg/L，于-18 ℃保存，保质期为6个月。用甲醇稀释为20.0 mg/L的中间液。

1.2.2标准工作液。用流动相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)稀释标准中间液20.0 mg/L 的盐酸可乐定、盐酸赛庚啶分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的标准工作液，现配现用。

1.3仪器条件

1.3.1液相色谱条件。色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)(梯度洗脱)；梯度洗脱程序：0～0.5 min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1 min；3.6 min，20%B保持1.4 min。流速:0.2 ml/min,柱温箱温度：25 ℃；进样量10 μl。

1.3.2质谱条件。离子源为电喷雾离子源(ESI)；正离子方式检测，采用多反应离子(MRM)监测，内标法定量。喷雾毛细管电压1.5 kV，离子源温度150 ℃，去溶剂气温度500 ℃，去溶剂气流速为1 000 L/h,碰撞气流速0.20 ml/min，放大倍数为600。数据应用软件MassLynx version 4.1进行分析。

1.3.3标准溶液及样品的测定。在上述方法下，标准溶液及加标样品中盐酸可乐定、盐酸赛庚啶的峰形良好。标准溶液中盐酸可乐定、盐酸赛庚啶的色谱图见图3，猪肉中的加标样品色谱图见图4，猪肉空白样品于保留时间处无干扰，色谱图见图5。

1.4样品前处理称取猪肉样品2 g,加入盐酸可乐定、盐酸赛庚啶标准溶液20 mg/L 25.0 μl。用10 ml 0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，匀浆1 min,振荡30 min,120 000 r/min离心5 min，倒出清液，再加入10 ml 0.01 mol/L HCl再按上述方法提取一次，合并2次提取液，混匀。取5 ml提取液准备过柱。取WCX柱，依次用6 ml甲醇，6 ml 0.01 mol/L HCl润洗，5 ml提取液上样。依次用纯水，20%甲醇水清洗，抽干，用5 ml 1 mol/L乙酸甲醇洗脱,40 ℃水浴氮气吹干，用1 ml 0.1%甲酸水+甲醇(80+20)定容，过0.25 μm滤膜。

2结果与分析

2.1样品前处理过程的优化

2.1.1提取溶剂的选择。根据盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的化学性质，选择应用甲醇∶0.1 mol/L HCl=80∶20,甲醇∶水=1∶1，乙酸乙酯-异丙醇(6∶4，V/V)来提取猪肉中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。

结果表明，用0.1 mol/L HCl酸化甲醇提取，可获得最高的回收率，最终采用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取猪肉中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶。

2.1.2SPE柱的选择。称取猪肉样品2 g,加入盐酸可乐定、盐酸赛庚啶标准溶液20 mg/L 25.0 μl。按照“1.4”方法进行提取,考察提取液在WCX、SCX、C18,MCX柱上的保留情况。过柱方法按照“1.4”方法进行。经UPLC-MS-MS测定后，结果显示，猪肉样品提取液中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶在WCX柱上保留效果最好，加标回收率最高。故选择WCX柱。

2.1.3洗脱液的选择。根据盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的化学性质及相关文献，选择氨化甲醇、乙酸甲醇、含2%氨水的甲醇水(1∶1,V/V)溶液，作为洗脱液，考察其洗脱效果。加标样品按照“1.4”方法操作，上机测试。结果显示，应用乙酸甲醇洗脱，回收率最高。而后又选择了1、2、5 mol/L的乙酸甲醇进行加标回收试验，结果显示，各种浓度的乙酸甲醇溶液均可获得较好的回收率，2 mol/L的乙酸甲醇所获得的回收率最高，故选择2 mol/L的乙酸甲醇作为洗脱液。

2.2仪器条件的选择用1 000 μg/L的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶溶液来确定合适的离子。离子源为电喷雾离子源(ESI)；经过优化流动相和质谱参数，发现盐酸可乐定和盐酸赛庚啶在正离子模式下的反应离子监测灵敏度显著优于负离子模式，该试验采用正离子扫描监测模式。在优化了碰撞条件后，获得了最佳质谱条件：喷雾毛细管电压1.5 kV，离子源温度150 ℃，去溶剂气温度500 ℃，去溶剂气流速为1 000 L/h,碰撞气流速0.20 ml/min，放大倍数为600。优化好质谱条件后，开始优化流动相与液相色谱柱。选择Acquity HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)柱和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)柱比较盐酸可乐定和盐酸赛庚啶在这2种柱子上的保留效果。试验发现，在相同的流动相和色谱条件下，盐酸可乐定和盐酸赛庚啶在Acquity HSS T3柱上的信号强度明显低于在Acquity BEH C18柱，因此选择Acquity BEH C18柱作为分析柱。在流动相优化方面，发现盐酸可乐定和盐酸赛庚啶在甲酸水-乙腈体系中的灵敏度低于在甲酸水-甲醇体系中的灵敏度，因此选择0.1%甲酸水-甲醇体系作为流动相。

2.3标准曲线与线性范围用流动相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)配制标准工作液1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L。经LC-MS-MS测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，如图6，图7。结果显示，在该浓度内，盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的线性范围良好，回归方程和相关系数分别为y=4 270.2x+18 352,R2=0.998 6;y=4 118.8 x+6 156.2,R2=0.997 8。

2.4灵敏度根据测定标准曲线所得的结果，配制相近浓度的阳性添加样品，按照“1.4”进行操作，测定其实际信噪比。以信噪比S/N≥3为检测限，以信噪比S/N≥10为定量限。试验结果表明，猪肉样品中盐酸可乐定的检出限为0.2 μg/L,定量限为0.6 μg/L；盐酸赛庚啶的检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.6 μg/kg。

2.5精密度和回收率称取猪肉样品2 g，制成1.0、2.0、4.0 μg/kg的添标样品，按照“1.4”进行操作，每个添加水平重复3次，每次每个浓度5个添加样品进行定量分析。结果表明，在猪肉样品中，盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的批内和批间的精密度均小于10%，回收率均在85%～100%，如表1、表2。

表1　猪肉样品中盐酸可乐定的回收率和精密度测定结果

表2　猪肉样品中盐酸赛庚啶的回收率和精密度测定结果

3结论

该试验制定了一种猪肉样品中盐酸可乐定和盐酸赛庚啶的测定方法。利用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，WCX固相萃取小柱净化，UPLC-MS-MS法测定。应用这种方法测定猪肉中的盐酸可乐定和盐酸赛庚啶，简便、快捷，检出限低，回收率高，为猪肉中可乐定和赛庚啶的测定提供了可靠的技术手段。

参考文献

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