HPLC-MS/MS法测定巢湖水产品中抗生素残留量

2015-12-26王华章,王晨晨,唐俊

安徽农业科学 2015年22期

王华章1，王晨晨2，唐俊2

(1.安徽省合肥市长丰县环境保护局，安徽长丰 231199；2．安徽农业大学资源与环境学院，安徽合肥 230036)

摘要[目的]了解巢湖湖区鱼虾体内抗生素的残留现状。[方法]从湖区渔船和岸边集市采集鱼虾样品22份，采用高效液相色谱-串联质谱法进行抗生素检测。[结果]磺胺类、喹诺酮类和四环素类15种抗生素共有5种抗生素被检出，分别为磺胺嘧啶、磺胺氯达嗪、洛美沙星、恩洛沙星和氧氟沙星，平均浓度为0.21～1.94 μg/kg，均未超过食品中抗生素限量标准。22份样品中检出抗生素较多的是河虾、白米虾和鲤鱼等底栖杂食性鱼类。[结论]巢湖湖区水产品中抗生素残留水平较低，符合食品安全标准。

关键词抗生素；鱼；虾；残留；巢湖；高效液相色谱-串联质谱

中图分类号S851.34+7

作者简介王华章(1980-)，男，安徽长丰人，助理工程师，从事环境监测与环境管理。

收稿日期2015-06-29

Investigation of Antibiotics Residue in Aquatic Food in Chaohu Lake by HPLC-MS/MS

WANG Hua-zhang1, WANG Chen-chen2, TANG Jun2(1. Agency of Environment Protection of Changfeng County, Changfeng, Anhui 231199; 2. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036)

Abstract[Objective] To investigate the residue of antibiotics in aquatic food in Chaohu Lake, China. [Method] Antibiotics were detected by HPLC-MS/MS in 22 samples of fish and shrimp collected form fishing ship and fish market besides Chaohu Lake. [Result] Sulfadiazine, sulfachoropyridazine, lomefloxacin, enrofloxacin and ofloxacin were quantified among 15 antibiotics with concentrations ranged from 0.21 to 1.94 μg/kg. Fortunately, concentrations of antibiotics in fish and shrimp were not excess the residue standards of antibiotics in aquatic food. Cyprinus carpio, Leander modestus Heller and Macrobrachium nipponense which live in bottom of Chaohu Lake had higher detected frequencies among all samples. [Conclusion] Aquatic food in Chaohu Lake had a low level of antibiotics residue and could meet the national food safety standard.

Key words Antibiotics; Fish; Shrimp; Residue; Chaohu Lake; HPLC-MS/MS

我国是抗生素最大生产国和消费国，抗生素使用后大多数不能被生物体完全吸收利用[1]，大部分以原药或代谢产物(氧化产物、共轭态、水解产物等)形式随粪便和尿液等排泄物排入水体等环境中，由于其持续性地进入使水体已经成为环境中抗生素最重要的归宿地之一[2]。我国陆续在长江三角洲、渤海、香港维多利亚港和珠江广州河段等水域检测出磺胺、四环素、喹诺酮类等多类抗生素残留[3-8]。水中抗生素可通过食物链形式进入水生动物体内进行富集[9]，水产品中抗生素残留是危害人体健康的因素之一[10]。近年来，我国在水产品中屡次发生抗生素污染事件[11-16]，由于抗生素的滥用从而导致的水产品污染问题越发严重。巢湖是我国第五大淡水湖，由于流域内畜禽养殖及城市排水的影响，水质较差。研究表明，巢湖渔业资源有减少的趋势，并且与水质恶化有直接的关系[17]。目前有针对巢湖白米虾中重金属污染现状的调查研究[18]，而有关巢湖鱼虾中抗生素污染现状的研究尚未见报道。笔者对巢湖湖区野生鱼虾等水产品中磺胺类、喹诺酮类和四环素类15种抗生素进行了测定，旨在探讨鱼虾中抗生素残留现状，为巢湖水产品的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集样品于2012年9月和2013年1月采自巢湖湖面鱼虾捕捞作业船只及忠庙码头集市，均为新鲜样品，共22份。其中，鱼样品种有鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳡鱼(Elopichthysbambusa)、鲇鱼(Silurusasotus)、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鳊鱼(Parabramispekinensis)、鲫鱼(Carassiusauratus)、刀鲚(Coiliaectenes)、翘嘴鲌(Culteralburnus)、太湖新银鱼(Neosalanxtaihuensis)、大银鱼(Protosalanxhyalocranius)、马口鱼(Opsariichthysuncirostrisbidens)、间下鱵鱼(Hyporhamphusintermedius)；虾样品种有白米虾(LeandermodestusHeller)及河虾(Macrobrachiumnipponense)。样品采集后立即放入聚四氟乙烯塑料袋中密封并冷藏，2 h内运回实验室处理。

1.2仪器与设备超高效液相色谱-串联质谱仪(Xevo TQ MS，美国Waters公司)；超声波清洗器(KQ-5200型，昆山市超声仪器有限公司)；高速组织捣碎机(德国IKA公司)；水浴振动器(SHZ-82型，金坛市医疗器械厂)；氮吹仪(N-EVAPTM112，Organomation Associates, Jnc)；pH计(PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司)；电子天平(FA2104A型，上海精天仪器有限公司。

1.3试剂与材料乙二胺四乙酸二钠，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷、甲醇、正己烷、甲酸、盐酸均为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司；磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SM2)、磺胺氯哒嗪(Sulfachoropyridazine，SCP)、磺胺间二甲氧嘧啶 (Sulfadimethoxine，SDM) 、诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)、双氟沙星(Difloxacin, DIF)、洛美沙星(Lomefloxacin, LOM)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin, ENR)，纯度均不低于99%，购自Sigma公司；四环素(Tetracycline，TC)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、金霉素(Chlorteracycline， CTC)、强力霉素(Doxycycline， DOC)标准品，纯度不低于95%，购自BIO BASIC INC公司。用0.1 mol/L盐酸溶液溶解配成0.5 g/L储备液，置于棕色容量瓶中避光4 ℃条件下保存，临用时根据需要稀释成适当质量浓度的混合标准溶液。

1.4样品的预处理鲢鱼、鳙鱼等大型鱼先将鱼体表面杂质洗净，去掉鳞、内脏，取肉(包括脊背和腹部)和皮一起，放入高速组织捣碎机中均质；太湖新银鱼等小型鱼弃去头部及鱼鳍，放入高速组织捣碎机中均质；虾样去其头和壳后放入高速组织捣碎机中均质。样品混合均匀后，装入清洁容器内，并标明标记。

称取2.0 g(精确至0.01 g)样品于50 ml聚乙烯离心管中，加入20 ml乙腈-二氯甲烷(95∶5，V/V)混合溶剂，于涡旋振荡器振荡提取2 min后置于超声波清洗器中超声提取10 min，再置于水平振荡器上振摇提取15 min，4 500 r/min离心5 min，将上清液转移至150 ml浓缩瓶中。重复提取1次，合并提取液，然后在40 ℃下旋转浓缩至近干。用5 ml甲醇溶解并转移至10 ml容量瓶中，N2吹干后准确加入2.0 ml 15%甲醇水溶液并超声助溶，用2 ml正己烷萃取杂质，弃去正己烷后过0.22 μm滤膜，待测定。

1.5试验方法

1.5.1色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流速：0.15 ml/min；进样量：10 μl；流动相A:甲醇/水(V/V为2∶98)+0.1%甲酸；流动相B:甲醇+0.1%甲酸，流动相采用梯度洗脱,具体如表1所示。

表1　 UPLC-ESI-MS/MS系统流动相梯度洗脱条件

1.5.2 质谱条件。电离方式：ESI+；毛细管电压：3 kV；离子源温度：150 ℃；锥孔反吹气流量：50 L/h；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；监测模式为MRM模式，离子监测条件具体见表2。

1.5.3方法学验证。为了消除样品基质效应，以空白样品提取液为标准溶液的稀释溶液，将3类抗生素混合溶液逐级稀释成标准工作液进行测定，采用外标法定量。以各组分的峰面积(Y)对质量浓度(X，μg/L)绘制标准曲线，得到15种抗生素的线性方程。

1.5.4鱼虾中抗生素残留量的测定。采用建立的HPLC-MS/MS方法测定巢湖鱼虾中15种抗生素的残留量。

2 结果与分析

2.1方法学验证结果由表3可知，在0.5～100 μg/L范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.995。以信噪比S/N=10，计算定量限(LOQ)为0.14～11.64 μg/kg。采用不含抗生素的空白样品进行25和250 μg/kg的加标回收试验，每个浓度重复5次，15种抗生素的回收率为58%～107%，变异系数为2.3%～15.3%，说明该方法具有较好的准确性和重复性。

表2　目标抗生素的质谱监测参数

注：*为定量子离子。

表3　鱼虾中15种抗生素回收率和定量限

2.2巢湖鱼虾中抗生素的残留量由表4可知，15种抗生素中磺胺类和沙星类有5种被检出，分别为磺胺嘧啶、磺胺氯达嗪、洛美沙星、恩洛沙星、双氟沙星和氧氟沙星，平均浓度范围为0.21～1.94 μg/kg。4种四环素类抗生素均未检出。从检出样品来看，白米虾、河虾、马口鱼、鲤鱼、刀鲚、鲫鱼、鳙鱼有抗生素检出，且白米虾、河虾、鲤鱼检出率较高，说明巢湖中这3种水生动物体内易富集抗生素。水体底泥是大部分污染物的富集区，而虾类和鲤鱼都是喜栖息在湖底淤泥部分，同时鲤鱼是杂食性鱼类，喜食底栖动物或底泥中的有机物，因此其体内抗生素含量较高。

参照我国《无公害水产品中渔药残留限量》(NY5070-2002)规定，各种抗生素的残留浓度上限为：磺胺类抗生素总

和为100 μg/kg，恩诺沙星为100 μg/kg，洛氟沙星和环丙沙星为50 μg/kg，四环素类为100 μg/kg。若氧氟沙星和双氟沙星参照50 μg/kg的标准。由表4可知，巢湖鱼虾中检出抗生素浓度最高为1.94 μg/kg，残留量均不超过标准。

表4　巢湖鱼虾体中抗生素的检测结果

注:ND表示未检出或低于检出限；磺胺类药物总和标准值为100。

3小结

巢湖鱼虾体内抗生素含量总体较低，共检出磺胺嘧啶、磺胺氯达嗪、洛美沙星、恩洛沙星、洛美沙星和氧氟沙星5种抗生素，平均浓度为0.21～1.94 μg/kg，残留浓度均未超过限量标准。底栖和杂食性为主的河虾、白米虾和鲤鱼检出抗生素较多，说明底栖活动水生动物体内易富集抗生素。

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