不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异分析

不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异分析

梁文涓1,闫 勇2

(1.沈阳建筑大学市政与环境工程学院，辽宁沈阳 110168；2.沈阳建筑大学土木工程学院，辽宁沈阳 110168)

摘要[目的] 研究不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异,为多氯联苯污染场址的生态修复提供借鉴。[方法] 应用PCR-DGGE技术对8种驯化手段下的活性污泥进行分析。[结果]加入同一种PCB单品的体系中，生物群落的相似度相对较高；好氧体系之间的相似性较好氧与厌氧体系之间的相似性要高；在好氧条件下，高氯PCB体系较低氯PCB体系中生物相丰富；好氧体系较厌氧体系的生物相丰富；一些物种在好氧体系和厌氧体系中均存在。[结论]该研究有利于多氯联苯降解菌库的充实和完善。

关键词多氯联苯；PCR-DGGE；活性污泥；群落结构

中图分类号S188;X171.4

作者简介梁文涓(1990-)，女，山西长治人，硕士研究生，研究方向：污染修复生态学。

收稿日期2015-06-01

Analysis on the Community Structure of PCBs Degrading Bacteria under Different Domestication Means

LIANG Wen-juan1, YAN Yong2(1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168; 2. School of Civil Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168)

Abstract[Objective] The aim was to analyze the differences of community structure of PCBs degrading bacteria under different means of domestication means, and provide references for the ecological restoration of contaminated sites by polychlorinated biphenyls.[Method] PCR-DGGE technology was used to analyze the activated sludges under 8 kinds of domesticated methods. [Result] To join the same kind of PCB item system, the similarity of biological communities was relatively high; In aerobic system the similarity was higher than between aerobic and anaerobic systems; Under aerobic conditions, biological phase in the high chlorine PCB system was richer than in low chloride PCB system; biological phase in aerobic system was recher than the anaerobic system; Some species was exsited in aerobic system and anaerobic systems. [Conclusion]Some empirical rules were obtained, which was conductive to the enrichment and improvement of the library of PCBs degradation bacteria.

Key words Polychlorinated biphenyls; PCR-DGGE; Activated sludge; Community structure

微生物降解被认为是PCBs在自然界中降解的主要途径，有关此类的研究相当活跃。近年来在其基础上发展起来的应用生物降解原理治理被污染环境的生物修复技术发展很快，由于其经济、安全，能处理的阈值低、残留少，其应用前景十分广阔。研究不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异可以为多氯联苯污染场址的生态修复提供借鉴。

变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技术是基于核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列分开[1]。不同序列的DNA片段都有一个或多个溶解区域，首先在解链温度较低的碱基区域开始解链，即DNA中A∶T碱基区域首先溶解，而G∶C含量高的区域仍保持双链。部分溶解的DNA双链最后停留在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停滞[2]，这种电泳迁移率的差异经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。由于DNA分子中G∶C碱基对比A∶T碱基对结合更为牢固，G∶C含量高的区域需要较高的解链温度。为了提高DGGE对序列差异的分辨率，通常在引物的3′端加上一个“GC夹板”(GC-clamp)，一般含有30～50个碱基，从而形成一个人工高温解链区，使DNA片段的原有部分由于处在低温解链区，从而实现更好的分离效果。通过“GC夹板”与PCR技术相结合，运用DGGE技术可检测PCR扩增DNA片段的多态性，分辨具有相同或相近分子量目的片段的序列差异，进一步分析活性污泥微生物群落中优势种群以及群落结构多样性。该技术是目前研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。笔者应用凝胶分析软件BandScan5.0对DGGE图谱的条带进行影像定位和相似性分析，并建立系统发育树，进行聚类分析。

1 材料与方法

1.1 活性污泥DNA提取取天津市纪庄子污水处理厂和天津市大沽化工污水处理厂处理过程中的活性污泥。

50 ml培养体系中有10 ml活性污泥混合液，加入不同的PCB单品(表1)，浓度均为5 mg/L，培养基成分同富集培养基。

按Biospin Bacteria Genomic DNA提取试剂盒的使用说明书对上述预处理后污泥混合液的细菌DNA进行提取，最终得到100 μl DNA溶液置于-20 ℃冷冻保存。对编号1～8活性污泥体系的DNA逐一进行提取。

表1　 DNA提取体系

注：1～6为好氧降解体系，7和8为厌氧降解体系。

提取出的DNA溶液在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳条件：电压120 V，上样液为6×Loading Buffer，上样比例为DNA溶液10 μl+6×Loading Buffer 2 μl，每个DNA提取体系设2个上样点，每个泳道上样量为20 μl，Marker为λ Hind III，电泳时间为50 min。

1.2 PCR扩增将提取的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。扩增引物1为带有一“GC夹”[3](5′-CGCCCGCCGCGCGGCGGCGGGCGGGGCGGCACGGGGGG-3′)的357F(5′-GC clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；扩增引物2为518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，扩增产物片段长约为600 bp[4]，引物浓度调节到0.1～1.0 μmol/L。

（3）项目直接负责的单位领导层，没有基本的责任意识，再者缺乏专业的项目指导，也没有专业的技术支持团队，因此很难保证工程的质量。一般存在于项目前期阶段不完整，施工中形成的更多的矛盾，使施工方疲于应付各种局部的矛盾，削弱了能源管理的质量。，总而言之，巧妇难为无米之炊，专业设备投资力度不够，技术水平不到位，再加上没有资深的专业技术人员和施工团队，也没有核心的管理的网系关系，施工团队组织涣散，好像打仗的军队溃不成军，如何能够保证效率和质量。

50 μl反应体系：1 μl DNA模板，25 μl 2×PCR Master Mix(含有3 mmol MgCl2、0.2 mmol/L的dNTP、0.1 U/μl的TaqDNA聚合酶和2×PCR缓冲液)，2 μl引物1，2 μl引物2，其余用无菌超纯水补足50 μl[5]。

PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后在72 ℃下延伸2 min。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。电泳条件：电压90 V，每个泳道上样量为15 μl，Marker为λ Hind III ，电泳时间为50 min。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1.3.1 PCR产物变性梯度凝胶电泳分析。将总细菌PCR产物用变性梯度凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE。使用梯度混合器制备6%～l2%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度30%～50%。在150 V、60 ℃的条件下电泳6.5 h。电泳完毕后，将凝胶进行硝酸银染色。

1.3.2 DGGE图谱分析。应用凝胶图像分析软件BandScan5.0对扫描所得的DGGE图谱进行条带分析，获取条带的数字化信息，然后用NTSYS-PC软件计算材料间的Dice遗传相似系数进行相似度分析，按不加权成对算术平均法(UPGMA)建立系统聚类分支树状图进行聚类分析，评价样品微生物群落结构。

2 结果与分析

2.1 PCR产物电泳结果将PCR产物取样15 μl进行变性梯度凝胶电泳，结果见图1。

2.2 变性梯度凝胶电泳分离扩增结果将8个驯化体系所得的16S rRNA片段通过变性梯度凝胶电泳。应用凝胶分析软件BandScan对扫描所得的DGGE图谱进行条带分析，获取条带的数字化信息。由图2可知，分离得到一系列条带，根据条带对比的结果，根据戴斯系数(Dice coefficient)计算出各样品相似性矩阵(表2)，最大相似度为0.806(体系5和体系6)，最小相似度为0.627(体系2和体系4)。相似性高说明体系中生物群落相似性越高；相似性低说明微生物群落多样化。

由图3可知，1～6好氧体系中，来自大沽化工厂活性污泥的体系条带个数明显多于纪庄子污水处理厂。天津大沽化工厂以食盐电解为基础，另外还生产烧碱、聚氯乙烯树脂、环氧丙烷、聚醚、液体氯、合成盐酸等产品，是一家综合性大型氯碱企业，该厂废水的含氯有机物种类繁多，造成了活性污泥中特殊的微生物群落。因此，大沽化工厂的污泥中适应PCBs的微生物相明显比处理生活污水的纪庄子污水处理厂污泥的微生物相丰富。该研究中厌氧体系只有2个，可以作为对照。

在四氯代的体系中(体系3、4、7、8)，好氧条件下，大沽化工厂的污泥体系(体系4)可利用PCBs的微生物比纪庄子的污泥体系(体系3)丰富；而厌氧条件下，纪庄子的污泥体系(体系4)可利用PCBs的微生物比大沽化工厂的污泥体系(体系3)丰富。

从氯取代的个数来看，可利用四氯代的PCBs微生物可能比可利用二氯联苯、五氯联苯的种类更多。

表2　 8个驯化体系微生物群落结构的相似性矩阵

由图2可知，每个样品各分离出不同位置的电泳条带，各条带的形成是基于PCR产物产量和迁移率的不同，因此可以表征污泥样品中优势菌群的分布[6]。根据DGGE对不同DNA片段的分离原理，可以得知样品的PCR产物中既含有相同的DNA片断，也含有多种不同的DNA片断。从原理上，每一个片断可以代表一个微生物种属，条带信号越强，该种属在污泥中具有越明显的优势地位。

2.3 聚类分析通过NTSYS-PC软件对DGGE指纹图谱进行UPGMA聚类分析(图4)。当相似度为0.72时，8个体系可聚为3类。

类I包含2个体系，分别是：添加二氯联苯(2,2′-二氯联苯)和纪庄子污水处理厂活性污泥的好氧体系(编号1)、添加二氯联苯(2,2′-二氯联苯)和大沽化工厂活性污泥的好氧体系(编号2)。两者均为好氧培养条件下添加二氯联苯(2,2′-二氯联苯)的体系。

类II有5个体系，分别是：添加四氯联苯(3,3′,4,4′-四氯联苯)的纪庄子污水处理厂的好氧体系(编号3)、添加四氯联苯(3,3′,4,4′-四氯联苯)的大沽化工厂活性污泥的好氧体系(编号4)、添加五氯联苯(2,2′,3,4,5-五氯联苯)的纪庄子污水处理厂活性污泥的好氧体系(编号5)、添加五氯联苯(2,2′,3,4,5-五氯联苯)的大沽化工厂活性污泥的好氧体系(编号6)、添加四氯联苯(3,3′,4,4′-四氯联苯)的纪庄子化工厂活性污泥的厌氧体系(编号7)。

类III只有一个体系：添加四氯联苯(3,3′,4,4′-四氯联苯)的大沽化工厂活性污泥的厌氧体系(编号8)。

3 结论与讨论

该研究总体呈现如下规律：①加入同一种多氯联苯单品的体系中，生物群落的相似度相对较高；②好氧体系之间的相似性较好氧与厌氧体系之间的相似性要高；③在好氧条件下，高氯PCB体系较低氯PCB体系中生物相丰富；④好氧体系较厌氧体系的生物相丰富；⑤一些物种在好氧体系和厌氧体系中均存在。

采用不同驯化手段分析了多氯联苯降解菌群落结构差异性，该研究主要从好氧、厌氧，以及加入不同的多氯联苯单品形成不同的驯化环境，对多氯联苯降解菌进行定向驯化。通过NTSYS-PC软件对DGGE指纹图谱进行UPGMA聚类分析，可以了解多氯联苯降解菌群落结构差异性以及相关性，得出一些经验性的规律，有利于多氯联苯降解菌库的充实和完善。

参考文献

[1] 张振冬,王淑芬,曹宇峰.DGGE技术及其在海洋环境微生物多样性研究中的应用[J]．海洋环境科学，2008，27(3):298-300．

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