绣球菌水溶多糖的提取及其抑菌效果

绣球菌水溶多糖的提取及其抑菌效果

亢 爽，刘 娜，张丽霞*

(大庆师范学院生命科学学院，黑龙江大庆 163712)

摘要[目的] 从绣球菌中提取水溶多糖，研究其抑菌的效果，为绣球菌的开发利用提供试验依据。[方法] 采用水煮醇沉法获得绣球菌水溶粗多糖，并采用三氯乙酸法对其进行脱蛋白后，通过滤纸片法和平板打洞法研究水溶粗多糖与脱蛋白后多糖的抑菌效果。[结果] 水溶粗多糖含量与得率分别为28.5%、3.0%；脱蛋白后糖含量与得率分别为48.9%、2.2%。绣球菌水溶多糖与去蛋白多糖对大肠杆菌抑菌效果明显，滤纸片法去蛋白多糖最小抑菌浓度低于1.6 mg/ml;平板打洞法去蛋白多糖最小抑菌浓度低于25 mg/ml, 对酿酒酵母、根霉菌、黑曲霉具有抑菌效果；去蛋白水溶多糖抑菌效果较水溶粗多糖好。[结论]绣球菌水溶多糖对不同菌具有不同的抑菌效果。

关键词绣球菌；水溶多糖；脱蛋白；抑菌效果

中图分类号S-03

基金项目黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201410235006)。

作者简介亢爽(1992-)，男，黑龙江哈尔滨人，本科生，专业：生物技术。*

收稿日期2015-06-10

Extraction of Water Soluble Polysaccharide inParassiscrispaand Its Antibacterial Effect

KANG Shuang, LIU Na, ZHANG Li-xia*(School of Life Science, Daqing Normal College, Daqing，Heilongjiang 163712)

Abstract[Objective] The water soluble polysaccharide was extracted from Parassis crispa and the antibacterial effect was studied to provide the experimental basis for the development and the utilization of Parassis crispa. [Method] The water boiling and alcohol precipitation was adopted to obtain the water soluble crude polysaccharide in Parassis crispa, and trichloroacetic acid method was used to deproteinize the polysaccharide. The antibacterial effects of water soluble polysaccharide and deproteinization polysaccharide were studied with filter paper method and agar plate hole method. [Result] The content of water soluble crude polysaccharide and the yield were 28.5% and 3.0%, and the content of deproteinization polysaccharide and the yield was 48.9% and 2.2% respectively. The antibacterial effect of water soluble polysaccharide and deproteinization polysaccharide on Escherichia coli was obvious, and the minimal inhibitory concentration of deproteinization polysaccharide with the filter paper method was below 1.6 mg/ml. Minimal inhibitory concentration of deproteinization polysaccharide with agar plate hole method was below 25 mg/ml. It had the antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus and Aspergillus niger. And the bacterial effect of deproteinization polysaccharide was better than that of water soluble polysaccharide. [Conclusion] The water soluble polysaccharide in Parassis crispa has different antibacterial effect.

Key wordsParassiscrispa; Water soluble polysaccharide; Deproteinization; Antibacterial effect

真菌多糖是一类天然高分子化合物。随着药理学研究的不断深入，真菌多糖的研究已引起国内外学者的极大兴趣。真菌多糖作为生物效应调节剂，主要作用于机体的免疫系统，是通过对人体细胞的保健功能来实现的。目前，真菌多糖的研究主要集中在免疫调节功能、抗肿瘤、降血糖作用和抗氧化作用等方面，对真菌多糖的抑菌作用却鲜见报道。

绣球菌(Sparassiscrispa(Wulfl)Frl)又名绣球蘑、花椰菜菌、地花蘑、白地花、白绣球花，属无褶菌目(Aphyllophorales)绣球菌科(Sparass-idaceae)，是一种珍贵的食、药两用真菌，其高分子多糖含量可高达50%，具有抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、增强免疫力的功能[1-3]。香菇、杏鲍菇、榆耳等菌多糖对几种食品致病菌有明显的抑菌作用，抗菌作用机制与多糖成分有一定的关系[4]。我国目前对绣球菌多糖的研究主要集中在培养栽培等方面，对绣球菌多糖抑菌方面的研究鲜有报道，因此对绣球菌多糖抑菌效果的研究很有必要。

1 材料与方法

1.1材料绣球菌子实体、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、根霉、黑曲霉、酿酒酵母、细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，组成为牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 ml;真菌培养采用PDA培养基，组成为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 ml。

1.2方法

1.2.1水溶多糖的提取。采取水煮醇沉法。取绣球菌子实体，烘干，粉粹，水溶浸提2次，离心，合并滤液，浓缩，醇沉过夜，离心，沉淀洗涤，常规干燥，得到水溶粗多糖。

1.2.2多糖含量的测定。

1.2.2.1标准曲线的绘制。取无水葡萄糖50 mg，定容500 ml，取不同体积于试管中，加水至1.0 ml，加入浓度5%苯酚1.0 ml，混匀，再加入浓硫酸2.5 ml，混匀，静置，在490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.2.2.2多糖含量的测定。准确称取待测多糖5 mg，置于50 ml容量瓶，定容。吸取1.0 ml，加浓度5%苯酚1.0 ml，混匀，再加浓硫酸2.5 ml，混匀，静置，490 nm测吸光度，计算多糖含量。

1.2.3多糖的初步纯化。采取三氯乙酸法脱蛋白。取浓度50%粗多糖，将样品制成浓度5%糖溶液，冰浴，加入等体积浓度5%三氯乙酸，搅拌，在4 ℃放置4 h，调pH至中性，浓缩至原体积，离心，取上清液，置于干燥器干燥，得去蛋白多糖。

1.2.4多糖抑菌效果的影响。

1.2.4.1培养基配制。

(1)牛肉膏蛋白胨培养基。称取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂粉20 g，加入蒸馏水1 000 ml，搅拌溶化，分装，121 ℃，20 min高压蒸汽灭菌。

(2)PDA培养基。马铃薯去皮切块，加1 000 ml蒸馏水，煮沸10～20 min，纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 ml，加入葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，搅拌溶化，分装，121 ℃，20 min高压蒸汽灭菌。

1.2.4.2 供试菌种的活化及均悬液的制备。将供试菌接种于斜面，培养，活化，取一环于生理盐水，制备菌悬液，冷藏，备用。

1.2.4.3 滤纸片的制备。用打孔器将定性滤纸片制成直径5.0 mm的圆形滤纸片，灭菌，备用。

1.2.4.4 多糖对供试菌最小抑菌浓度的测定。配制多糖溶液，稀释不同浓度，浸泡滤纸片，将菌液涂平板，贴滤纸片，在恒温箱培养，观察抑菌效果。

1.2.4.5 水溶粗多糖与去蛋白多糖抑菌效果的比较。

(1)滤纸片法[5]。配制粗多糖和去蛋白多糖溶液，浸泡滤纸片，将菌液涂平板，贴滤纸片，在恒温箱培养，测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。

(2)平板打洞法[6-7]。配制粗多糖和去蛋白多糖溶液，将菌液涂平板，在培养基上打孔，加入适量粗多糖和去蛋白多糖，恒温箱培养，测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。

1.2.5 数据处理。 利用SPSS软件，处理试验数据。

2 结果与分析

2.1绣球菌多糖含量与得率精确称取10 g绣球菌粉末，采用水煮醇沉法提取绣球菌多糖。采用三氯乙酸法脱蛋白后，得去蛋白水溶多糖。根据酚硫酸法，得葡萄糖回归方程为：A=4.6×10-1C+1.1×10-3(R2=0.999 401)。

由表1可知，随着脱蛋白除杂，绣球菌水溶多糖含量明显增加，但多糖得率降低。

表1　绣球菌水溶多糖含量与得率　%

2.2多糖抑菌效果 由表2可知，绣球菌水溶多糖对酿酒酵母、根霉菌和大肠杆菌均有抑制作用，且不同菌受不同多糖种类的抑制，如大肠杆菌极易受脱蛋白的多糖抑制，最小抑菌浓度为1.6 mg/ml。

表2　采取滤纸片法测定绣球菌水溶多糖的抑菌效果　mg/ml

注：“0”表示无最小抑菌浓度。

表3　平板打洞法测定绣球菌水溶多糖的抑菌效果　mg/ml

注：“0”表示无最小抑菌浓度。

由表3可知，采取平板打洞法绣球菌多糖对根霉菌、黑曲霉和大肠杆菌均有抑制作用，最小抑菌浓度均为25 mg/ml。但是，不同菌受不同多糖种类的抑制。

3小结

一定浓度的绣球菌水溶多糖与去蛋白多糖对细菌及少数真菌均具有抑制作用，且脱蛋白水溶多糖较水溶粗多糖效果更显著。真菌较细菌不易受绣球菌多糖的影响，可能是由于其细胞壁的组成和结构的作用；去蛋白多糖较粗多糖的抑菌效果显著，可能是与多糖中某种成分的含量有关；采取滤纸片法测定绣球菌水溶多糖的抑菌效果较采取平板打洞法显著，可能是由于滤纸片具有渗透作用，使得多糖与菌液充分接触。

参考文献

[1] 裘维蕃,于永年.菌物学大全[M].北京:科学出版社,1998.

[2] 王雪冰,赵天瑞,樊建.食用菌多糖提取技术研究概况[J].中国食用菌,2010,29(2):3-6.

[3] 李颖,李庆典.桑葚多糖抗氧化作用的探究[J].中国酿造,2010,217(4):59-61.

[4] 陈颖，朱继红，雷秀云，等.榆耳发酵液抑菌作用的探讨[J]中国食用菌，1990，9(4)：5-7.

[5] 马建风,刘华刚,朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展[J].药物评价研究,2010,33(1):42-45.

[6] 曾维才,谭敏,张佳琪.不同抑菌方法在食品防腐剂效果评价方面的比较[J].食品安全质量检测学报,2010,27(3):112-117.

[7] 侯文九,杨凤影,王维新.中草药对刺参腐皮综合症病原菌的抑菌试验[J].中国农学通报,2013,29(5):76-80.