哇巴因抑制纤维连结蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

张明娟，杨 军，张美程，张超英，朱参战，段宗明(西安交通大学第二附属医院心内科，西安 70004;西安交通大学第二附属医院病理科;通讯作者，E-mail:zhangmingjuan@mail．xjtu．edu．cn)

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由细胞合成并分泌到胞外的多糖、蛋白或蛋白聚糖类大分子，分布在细胞表面或细胞之间，并形成复杂的网架结构，维持并调节细胞的生理功能［1－3］。纤维连结蛋白(fibronectin，FN)是ECM中的大分子细胞表面糖蛋白，通过特有的RGD(Arg-Gly-Asp)序列与细胞表面某些整合素受体结合，而将细胞连接到细胞外基质上［4］。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)通过自分泌、旁分泌和直接的物理接触机制与ECM相互作用，ECM可直接影响VSMCs分化状态和 VSMCs表型转换过程［5］，而VSMC表型转换是引起VSMC增殖和迁移的关键性起始步骤和血管重构根本原因，也是高血压、动脉粥样硬化和血管狭窄等疾病的共同发病基础［6］。钠泵(sodium pump)，也称 Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)，是一种广泛存在于真核细胞上的由α、β、γ亚基组成的跨膜蛋白，是维持细胞内外离子平衡、参与细胞通讯、细胞连结和细胞黏附的重要膜蛋白，其中钠泵α亚单位负责维持细胞内低Na+、高K+动态生理平衡状态，钠泵β亚单位可直接与钙黏蛋白(cadherin)共同作用参与形成细胞间连接、维持细胞原有极性、抑制细胞运动［7－9］。现已证实，内源性哇巴因(endogenous ouabain，EO)与钠泵α亚单位特异性位点结合，抑制钠泵的离子转运活性，从而在高血压病的发生、发展中发挥重要作用［10－12］。但钠泵α亚单位是否也参与细胞与ECM间的相互作用尚不清楚。因此，该研究拟通过分离培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，采用EO抑制钠泵活性，观察FN在VSMCs中的表达，探讨钠泵α亚单位离子转运活性在ECM形成中的作用，为阐明高血压的发病机制提供实验依据。

1 材料和方法

1．1 大鼠、主要试剂和仪器

SD大鼠(6周龄、雄性、150 g)购自西安交通大学医学院实验动物中心，DMEM细胞培养液购自Gibco公司(美国)，胎牛血清购自Hyclone公司(美国)，二步法免疫组化试剂盒EnVision-Detection Kit购自Dako公司产品(丹麦)，α-actin抗体购自福州迈新生物技术公司。SW-CJ超净工作台(苏州净化设备集团)，Heal Force HF90二氧化碳培养箱(力康生物医疗科技控股集团)，Leica DM3000倒置显微镜(德国 Leica)。

1．2 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养

按照常规方法分离、培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMC)［13］:取大鼠取出胸主动脉，剥除血管外膜并刮去内膜层细胞后，将其剪成1．0－2．0 mm2大小的组织块，均匀放置于培养瓶底，放入37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中，翻转培养瓶静置3 h后，向加入含20%胎牛血清及100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液培养，当细胞铺满整个瓶底时，即可传代培养。将第5代对数生长期的细胞悬液接种到96孔板中，当细胞铺盖孔底80%时，倒出培养液，10%甲醛固定，备用。

1．3 哇巴因对VSMC细胞的干预

将第5代对数生长期的细胞悬液接种到96孔板中，当细胞铺盖孔底80%时，倒置显微镜下选择生长状态良好的4列细胞，其中1列(8孔)作为对照继续培养，另3列分为3组(8孔/组)分别加入不同浓度(0，100，800 nmol/L)哇巴因培养24 h后，弃培养液，PBS缓冲液冲洗3次，10%福尔马林固定，备用。

1．4 免疫组织化学检测FN

按照Dako REALTMEnVisionTM免疫组织化学试剂盒说明书操作:在上述96孔板中固定备用的VSMCs细胞滴加3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，在第1列培养孔内分别滴加抗－α－肌动蛋白(α-actin)多克隆抗体，哇巴因干预的3列培养孔内加入抗－FN多克隆抗体(每列中留1孔细胞作为阴性对照)，室温孵育30 min，PBS冲洗，滴加ChemMateTMEnVision+HRP，室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，倒置显微镜下观察、拍照，并进行分析。按照胞质型分子判读标准进行判读:0(阴性)，无着色;1+(弱阳性)，≤10%细胞呈现不同程度的细胞质着色;2+(阳性)，10%－30%的细胞胞质呈现强的棕褐色着色，或≤70%细胞胞质呈现弱或中等强度质着色;3+(强阳性)，＞30%细胞胞质呈强的棕褐色着色，或＞70%的胞质呈中等强度着色［14］。同时，分别设置相应的阴性对照(不加一抗:抗α-actin多克隆抗体和抗FN多克隆抗体)。

1．5 统计学分析

采用SPSS 14．0软件进行统计学分析，阳性强度比较采用等级资料秩和检验(Kruskal-Wallis H)比较采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养及鉴定

在倒置显微镜下可见原代VSMCs从培养的SD大鼠胸主动脉组织块边缘游离爬出，呈现长梭形、不规则和三角形并连接成网状，细胞质较为丰富，细胞核居中，细胞折光性强(见图1)。同时，采用平抗α-actin抗体对VSMCs进行免疫组织化学鉴定，发现VSMCs细胞胞质内有棕褐色阳性颗粒，显示VSMCs特征性表达α-actin蛋白(见图1)。

2．2 哇巴因对VSMCs中FN表达的影响

在不同浓度(0，100，800 nmol/L)哇巴因作用下，VSMCs胞质内FN的表达随哇巴因的浓度增加而显著降低(见图2)，且各组间有显著差异(等级资料秩和检验，χ2=12．839，P=0．002，见表1)。

图2 哇巴因对VSMCs内FN表达的影响Figure 2 Effect of ouabain on expression of FN in VSMCs

表1 FN在VSMCs中的表达Table 1 The expression of FN in VSMCs

3 讨论

FN是EMC中大分子细胞表面糖蛋白，通过5－7个特定功能结构域与其他ECM(如胶原、蛋白聚糖)结合，参与ECM网络的形成和组织、器官的纤维化，并通过特有的RGD(Arg-Gly-Asp)序列与细胞表面某些整合素受体结合，而将细胞连接到细胞外基质上。对血管壁的损伤性刺激可通过引起ECM中FN含量增加而增强VSMC增殖活性［15］，并促进VSMC表型转化，诱导VSMC由收缩表型向合成表型转换，促进血管病变的发生发展。而FN的缺陷可导致多种心血管疾病的发生有关［16］。

现已证实，钠泵除介导与细胞增殖和死亡有关的信号传递外［17］，钠泵α亚单位负责细胞内Na+和细胞外K+交换，维持细内低Na+、高K+的动态生理平衡状态，钠泵β亚单位可直接与钙黏蛋白(cadherin)共同作用介导细胞间连接的形成、维持细胞原有极性、抑制细胞运动、细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)黏附等生理病理过程［18］。

既往研究证实，哇巴因是肾上腺分泌的内源性强心甙物质，可与细胞膜钠泵α亚单位上的特异性哇巴因结合位点结合，从而抑制钠泵的离子转运活性［19－21］，引起细胞内 Na+潴留，继而通过钠钙交换使细胞内Ca2+浓度出现升高，引起相应的生物学效应［22，23］，从而在高血压病的发生、发展中起到重要作用。但是，除此之外，由钠泵α亚基调控钠泵离子转运活性是否也参与细胞与细胞外基质间的相互作用尚不清楚。

因此，该研究通过分离培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，采用哇巴因抑制其钠泵活性，结果发现，哇巴因可显著降低大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞中FN的表达水平。说明细胞钠泵离子活性在ECM的形成和与细胞的相互作用中存在必然联系。这一结果也得到其他学者的支持，例如，有学者证实，哇巴因可因浓度不同而在细胞间通讯中发挥双向作用，低浓度哇巴因可下调间隙连接蛋白(connexin，Cx)的表达而降低细胞间隙连接(gap junction，GJ)的通透性，高浓度哇巴因(1－10 μmol/L)则可引起COS-1细胞选择性表达钠泵α1亚基，形成哇巴因抵抗低浓度［24－26］。哇巴因能在生理浓度通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)依赖性途径抑制黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、ATP依赖的酪氨酸激酶(ATP-dependent tyrosine kinase，Akt)和细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，Cdc42)降低肿瘤转移能力［27］。而 FN 可以活化FAK上调MMP-9的表达促进［28］。同时，机械性拉伸可引起心室肌细胞钠泵活性上调的同时，提高FN的表达，促进心肌成纤维细胞外基质的形成［29］。此外，有学者证实熊果酸(ursolic acid)能抑制癌细胞钠泵活性，而抑制FN、ICAM-1、MMP-2和MMP-9的表达［30］。可见，钠泵活性与FN的表达间存在直接相关性［31］。

总之，该研究证实，哇巴因能抑制钠泵活性，也可下调FN的表达，说明钠泵活性在调节血管平滑肌细胞与ECM之间的相互作用中发挥重要作用，也为深入探讨哇巴因的作用和高血压的发病机制提供新的线索。

［1］Rozario T，De Simone DW．The extracellular matrix in development and morphogenesis:a dynamic view［J］．Dev Biol，2010，341(1):126－140．

［2］Raines EW．The extracellular matrix can regulate vascular cell migration，proliferation，and survival:relationships to vascular disease［J］．Int J Exp Pathol，2000，81(3):173－182．

［3］Jourdan-Lesaux C，Zhang J，Lindsey ML．Extracellular matrix roles during cardiac repair［J］．Life Sci，2010，87(13－14):391－400．

［4］Chiang HY，Korshunov VA，Serour A，et al．Fibronectin is an important regulator of flow-induced vascular remodeling［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(7):1074－1079．

［5］Gu Z，Fonseca V，Hai CM．Nicotinic acetylcholine receptor mediates nicotine-induced actin cytoskeletal remodeling and extracellular matrix degradation by vascular smooth muscle cells［J］．Vasc Pharmacol，2013，58(1－2):87－97．

［6］Ponticos M，Smith BD．Extracellular matrix synthesis in vascular disease:hypertension，and atherosclerosis［J］．J Biomed Res，2014，28(1):25－39．

［7］Rajasekaran SA，Palmer LG，Moon SY，et al．Na，K-ATPase activity is required for formation of tight junctions，desmosomes，and induction of polarity in epithelial cells［J］．Mol Biol Cell，2001，12(12):3717－3732．

［8］Espineda CE，Chang JH，Twiss J，et al．Repression of Na，K-ATPaseB1-Subunit by the transcription factor snail in carcinoma［J］．Mol Biol Cell，2004，15(3):1364－1373．

［9］Cavallaro U，Liebner S，Dejana E．Endothelial cadherins and tumor angiogenesis［J］．Exp Cell Res，2006，312(5):659－667．

［10］Bagrov AY，Shapiro JI．Endogenous digitalis:pathophysiologic roles and therapeutic applications［J］．Nat Clin Pract Nephrol，2008，4(7):378－392

［11］Hamlyn JM，Blaustein MP．Salt sensitivity，endogenous ouabain and hypertension［J］．Curr Opin Nephrol Hypertens，2013，22(1):51－58．

［12］Hamlyn JM，Manunta P．Endogenous ouabain:a link between sodium intake and hypertension［J］．Curr Hypertens Rep，2011，13(1):14－20．

［13］Sreejayan N，Yang X．Isolation and functional studies of rat aortic smooth muscle cells［J］．Methods Mol Med，2007，139:283－292．

［14］杨军，康安静，苏宝山，等．免疫组织化学检测结果判读进展［J/CD］．中华临床医师杂志，2014，8(20):3699－3703．

［15］Hedin U，Holm J，Hansson GK．Induction of tenascin in rat arterial injury．Relationship to altered smooth muscle cell phenotype［J］．Am J Pathol，1991，139(3):649－ 656．

［16］Astrof S，Crowley D，Hynes RO．Multiple cardiovascular defects caused by the absence of alternatively spliced segments of fibronectin［J］．Dev Biol，2007，311(1):11－ 24．．

［17］Ren YP，Zhang MJ，Zhang T，et al．Dual effects of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells:involvement of Na(+)-K(+)-ATPase α-subunits and NF-κB［J］．Int J Clin Exp Med，2014，7(5):1214－1222．

［18］Tokhtaeva E，Sachs G，Sun H，et al．Identification of the amino acid region involved in the intercellular interaction between the β1 subunits of Na+/K+-ATPase［J］．J Cell Sci，2012，125(Pt 6):1605－1616．

［19］Lingrel JB．The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na，K-ATPase［J］．Annu Rev Physiol，2010，72:395－412．

［20］Schoner W．Ouabain，a new steroid hormone of adrenal gland and hypothalamus［J］．Exp Clin Endocrinol Diabetes，2000，108(7):449－454．

［21］Hamlyn JM，Blaustein MP，Bova S，et al．Identiication and characterization of a ouabain-like compound from human plasma［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(14):6259－6263．

［22］Fontana JM，Burlaka I，Khodus G，et al．Calcium oscillations triggered by cardiotonic steroids［J］．FEBS J，2013，280(21):5450－5455．

［23］Song H，Karashima E，Hamlyn JM，et al．Ouabain-digoxin antagonism in rat arteries and neurones［J］．J Physiol，2014，592(Pt 5):941－969．

［24］Martin PE，Hill NS，Kristensen B，et al．Ouabain exerts biphasic effects on connexin functionality and expression in vascular smooth muscle cells［J］．Br J Pharmacol，2004，141(2):374－384．

［25］Martin PE，Hill NS，Kristensen B，et al．Ouabain exerts biphasic effects on connexin functionality and expression in vascular smooth muscle cells［J］．Br J Pharmacol，2003，140(7):1261－1271．

［26］Nony PA1，Nowak G，Schnellmann RG．Collagen IV promotes repair of renal cell physiological functions after toxicant injury［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2001，281(3):F443－453．

［27］Pongrakhananon V，Chunhacha P，Chanvorachote P．Ouabain suppresses the migratory behavior of lung cancer cells［J］．PLoS One，2013，8(7):e68623．

［28］Meng XN，Jin Y，Yu Y，et al．Characterisation of fibronectin-mediated FAK signalling pathways in lung cancer cell migration and invasion［J］．Br J Cancer，2009，101(2):327－ 334．

［29］Guo Y1，Zeng QC，Zhang CQ，et al．Extracellular matrix of mechanically stretched cardiac fibroblasts improves viability and metabolic activity of ventricular cells［J］．Int J Med Sci，2013，10(13):1837－1845．

［30］Huang CY，Lin CY，Tsai CW，et al．Inhibition of cell proliferation，invasion and migration by ursolic acid in human lung cancer cell lines［J］．Toxicol In Vitro，2011，25(7):1274－1280．

［31］Belusa R，Aizman O，Andersson RM，et al．Changes in Na(+)-K(+)-ATPase activity influence cell attachment to fibronectin［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2002，282(2):C302－309．