羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

邓灿新， 田东升， 李春燕， 赵扬扬， 曾仁权*， 曹 政*

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460；2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 402460)

羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

邓灿新1， 田东升1， 李春燕2， 赵扬扬2， 曾仁权1*， 曹 政2*

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460；2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 402460)

摘要[目的]研制基于Eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴Eg95重组蛋白为检测抗原，筛选间接ELISA的最佳反应条件，确定ELISA的判定标准，检测敏感性和重复性，组成、包装试剂盒并初步应用。[结果]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好，检测阳性血清和阴性血清的准确率均为100%。[结论]研制的羊棘球蚴(包虫)病ELISA抗体检测试剂盒可用于细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。

关键词细粒棘球蚴；Eg95蛋白；试剂盒；ELISA

10002)。

我国是世界上棘球蚴病最严重的国家之一，我国西北地区(如甘肃、新疆、宁夏、内蒙古、青海、四川、陕西、西藏等)，棘球蚴病尤为严重[1]。棘球蚴病是我国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一,现已证实全国有31个省(市、区)存在包虫病感染病例,有100多万包虫病现症患者,受威胁人口达几千万,包虫病畜超过4 000万头,每年新发病畜达800多万头,年经济损失超过10亿元。该病已成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因[2-3]。对动物棘球蚴病的生前诊断比较困难，疫苗免疫已成为预防与控制棘球蚴病的重要途径，但是国内还没有相应的检测试剂盒来评价疫苗的免疫效果，这就亟需准确、有效的诊断方法的出现。为了建立简单、有效的ELISA抗体检测试剂盒，用于对疫苗的免疫效果进行及时监测，为羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位苗提供了配套的检测方法以评价疫苗的免疫效果，利用Eg95抗原的特异性和ELISA方法的快速、灵敏特点相结合研制出间接ELISA抗体检测试剂盒，旨在为促进细粒棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位苗的应用及包虫病的预防发挥重要作用。

1材料与方法

1.1重组Eg95蛋白和绵羊血清细粒棘球蚴Eg95重组蛋白，保存于-70 ℃冰箱中备用；绵羊血清均采自四川省邛崃市非疫区，保存于-20 ℃备用[4]。

1.2主要试剂HRP酶稳定剂和proclin300防腐剂均购自上海闪晶分子生物科技有限公司;包被缓冲液(pH9.6、0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液、TMB底物溶液、25×洗涤缓冲液(PBST)、样品稀释液、终止液、酶标二抗、标准阴性血清和阳性血清。

1.3阴性血清和阳性血清的制备取未注射Eg95基因工程亚单位苗、未感染包虫病的绵羊血清，经Western blot方法鉴定为阴性，即为阴性血清。SDS-PAGE电泳加样时，仅加入蛋白Mark与纯化后Eg95重组蛋白，转膜、分割后用于后续试验，第7步用1∶600倍稀释的待检血清作为一抗替代HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体溶液，37 ℃摇动(70 r/min)孵育1 h后，用PBST漂洗3次，用封闭液1∶2 000稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG作为二抗，37 ℃摇动(70 r/min)孵育1 h后，用PBST漂洗3次，加入TMB底物显色。

用Eg95基因工程亚单位苗对绵羊进行二次免疫，二免后1个月采血分离血凊，作为备选血清，选取60份备选血清和30份阴性血清用间接ELSA法测其OD450值。

1.4间接ELISA最佳反应条件的筛选

1.4.1棋盘法确定抗原包被量及血清稀释度。用包被缓冲液将纯化到的重组Eg95蛋白分别作0.5、1、2、4 μg/ml 4个倍比稀释度，包被酶标板，37 ℃温育1 h，然后4 ℃下过夜。用血清稀释液将阳性血清及阴性血清分别进行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍比稀释，组成方阵。其余条件不变，按照ELISA程序操作。结果判定以阳性血清OD450值(P)为1.000左右，阴性血清OD450值(N)低,且P/N值最大时的重组Eg95蛋白包被浓度和血清稀释度为最佳条件。

1.4.2血清最佳作用时间的确定。在最适抗原浓度和血清稀释度的基础上，将血清作用时间分别设定为30、45、60 min，其他步骤按照ELISA程序操作，测定OD450值，按照判断标准比较分析数据，以确定血清作用的最佳时间[5-6]。

1.4.3酶标二抗稀释度及作用时间的确定。已确定的条件不变，将酶标二抗进行 1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000稀释(即将二抗保护剂稀释后的二抗进行1∶50、1∶100、1∶150稀释)，分别于37 ℃条件下反应30、45、60 min，进行ELISA试验，测定OD450值，以确定酶标二抗的稀释度和作用的最佳时间。

1.4.4显色时间的确定。已确定的条件不变，将底物于37 ℃条件下作用时间设定为5、10、15、20 min，进行ELISA试验，终止反应后，比较分析数据，以确定底物作用的最佳时间。

1.5ELISA判定标准的确定用 60份阴性绵羊血清为样本按照已建立的方法进行检测，对检测结果进行分析，确定阴性和阳性的判定标准。

1.6敏感性检测用ELISA方法检测1份阳性血清，从1∶200开始进行一系列稀释后作为一抗,确定能够检测出阳性的最高血清稀释度。

1.7阻断试验选取3份按1∶100稀释阳性血清各100 μl，分别加入100 μl 10 μg/ ml重组Eg95蛋白，37 ℃下温育1 h，然后8 000 r/min离心5 min，取100 μl上清作为一抗应用该ELISA方法进行检测。同时，设置未阻断的1∶200稀释的阳性血清作为对照，比较2组血清的OD450值，观察重组蛋白能否阻断阳性血清反应。

1.8重复性检测

1.8.1批内重复性检测。取3份不同效价的绵羊阳性血清和3份绵羊阴性血清，每份血清作8个孔，用同一批包被的酶标板在相同条件下同时进行批内重复试验，计算标准差和变异系数。

1.8.2批间重复性检测。取3份不同效价绵羊阳性血清和1份绵羊阴性血清，每份绵羊血清作2个重复，用5个不同批次包被的酶标板，在相同条件下同时进行批间重复试验，计算标准差和变异系数。

1.9ELISA方法的初步应用随机选取45份Eg95亚单位苗二免四周后绵羊血清用建立的ELISA方法进行检测；随机选取 30份未免疫未患棘球蚴病绵羊血清30份进行ELISA检测。

1.10羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的组成及包装酶标板室温晾干后，用锡箔袋真空干燥(加干燥剂)包装酶标板，血清稀释版为没有包被抗原酶标板。试剂盒的组成如表1所示，试剂盒示意图见图1。

表1　试剂盒的组成

1.11试剂盒的保存期试验将同一批次制备的试剂盒置于4 ℃下保存，每月各取1个试剂盒，按照试剂盒说明书作标准阴阳性对照，并对同一份阳性血清进行敏感性测定，观察其敏感性的变化，以确定试剂盒的保存期限。

2结果与分析

2.1间接ELISA最佳反应条件的筛选结果

2.1.1Eg95重组蛋白的包被量和抗血清稀释度的确定。由表2可知，包被抗原浓度为 2 μg/ml、血清1∶200 稀释时，阳性血清OD450值在 1.000 左右，阴性血清OD450值较低，P/N值最高。因此，试验确定抗原的最佳包被浓度为 2 μg/ml，血清的最佳稀释度为 1∶200。

2.1.2血清最佳作用时间的确定。由表3可知，当血清作用时间为45 min时，阳性血清OD450(P)值在 1.000 左右，阴性血清OD450值(N)较低，且P/N值最大。因此，确定45 min为待测血清的最佳作用时间。

2.1.3酶标二抗稀释度及作用时间的确定。由表4可知，当酶标二抗以 1∶10 000 稀释作用 30 min 时，阳性血清OD450值(P)在 1.000 左右,阴性血清OD450值(N)较低，且P/N值最大。因此，确定酶标二抗以 1∶10 000 稀释，作用时间为30 min。

表2　抗原最适包被浓度及血清最佳稀释度的确定

表3　血清最佳作用时间的确定

表4　酶标抗体工作浓度及作用时间的确定

2.1.4底物最佳显色时间的确定。由表5可知，当显色时间为10 min时，P/N值最大，且阳性血清OD450值(P)也在1.000左右，阴性血清OD450值(N)较低。因此确定底物最佳显色时间为10 min。

表5　底物显色时间的确定

2.3敏感性检测结果取1份绵羊阳性血清从1∶200倍开始倍比稀释，进行间接ELISA检测。从图3可以看出，当血清稀释度为1∶25 600时结果仍为阳性。这表明建立的方法具有较好的敏感性。

2.4阻断试验结果用包被抗原蛋白和已知阳性血清进行阻断反应，结果表明，经重组Eg95蛋白处理过的3份阳性血清OD450值分别下降90.76%、90.53%和89.95%，表明该试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。

2.5重复性检测结果

2.5.1批内重复试验结果。针对建立的间接ELISA方法进行批内重复性试验，结果表明6份绵羊血清测得OD450值的变异系数为2.24%～5.56%，均低于10%，表明该间接ELISA方法批内重复性良好。

2.5.2批间重复试验结果。针对建立的间接ELISA方法进行批内重复性试验，结果表明4份绵羊血清测得OD450值的变异系数为5.40%～8.67%，均小于 10%，表明该间接ELISA方法的批间重复性良好。

2.6ELISA方法的初步应用结果用建立的ELISA方法对45份二免后绵羊血清和30份未免疫健康绵羊血清进行检测，结果表明二免后绵羊血清OD450值为0.595～1.608，均大于临界值，判定为阳性；未免疫绵羊血清OD450值为0.060～0.147，均小于临界值，判定为阴性。

2.7羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法①取抗原包被板，分别将稀释好的待检血清和标准对照各取100 μl加入到酶标板孔中，阴性对照和阳性对照各设2孔，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置于37 ℃条件下温育45 min；②取出96孔酶标板，倾去孔内液体，在吸水纸上拍干后每孔加入稀释过的1×洗涤液 200 μl，轻轻振匀孔中液体(勿溢出)，每次洗板2 min，每次洗完在干净吸水纸上拍干，共计洗板3次；③将兔抗绵羊酶标二抗用稀释液稀释100倍，混匀，每孔加酶标二抗100 μl，置于37 ℃条件下温育30 min；④洗板，方法同上，但需洗4次；⑤将底物A、底物B按1∶1的比例混匀后,每孔加入100 μl，37 ℃条件下避光显色10 min；⑥每孔加入终止液50 μl，10 min内在酶标仪上测各孔OD450值;⑦结果判定：标准阳性血清血清OD450值≥0.6，标准阴性血清OD450值≤0.159，ELISA试验成立，样品OD450值≥0.196时，判为阳性；当OD450值≤0.159时，判为阴性；若样品OD450值介于二者之间则判为可疑，需重新检测，若检测结果仍小于 0.196则判定为阴性。

2.8试剂盒保存期的试验结果由表6可知，7次ELISA试验标准阳性血清及标准阴性血清均成立，且保存6个月后检测标准阳性血清能检出为阳性的最高稀释度为1∶25 600，到第7个月标准阳性血清能检出为阳性的最高稀释度下降到1∶12 800，说明试剂盒的检测效果略有下降。这表明试剂盒在4 ℃条件下至少可以保存6个月。

表6　试剂盒保存期的测定结果

3讨论

ELISA检测试剂盒包被所用的抗原要求必须有优质和稳定等特点，纯度较高，抗原的纯度直接关系到ELISA试验的特异性和敏感性。抗原包被的浓度也对试验结果有着较大的影响。若抗原包被浓度过低，就会留下未吸附的抗原固相载体影响试验效果；若抗原包被浓度过高，就会使蛋白分子产生多层化现象，使蛋白容易被洗掉，从而出现非特异反应及造成抗原的浪费。通过对比0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml 4个包被浓度的试验结果，确定的最佳包被浓度为2 μg/ml。

若要得到准确而且重复性好的试验结果，就要求血清样品必须以一个最佳的稀释度来进行试验。经过对比1∶50、1∶100、1∶200和1∶400 4个稀释度和30、45、60 min 3个作用时间的试验结果发现1∶200倍稀释血清、作用45 min效果最佳。因此，试验选用1∶200来稀释血清，37 ℃作用45 min。另外，待测血清的保存对ELISA试验也非常关键，若对血清的保存不当将会导致假阳性和假阴性的结果出现，保存血清应添加防腐剂，少量分装后保存于-20 ℃条件下，避免反复冻融。

酶标二抗也是影响试验结果的重要因素。若酶标二抗浓度太低，不足以充分与血清中抗体结合；若酶标二抗浓度太高，又会造成非特异性吸附。经过对比1∶5 000、1∶10 000和1∶15 000 3个稀释度和30、45及60 min 3个作用时间的试验结果发现1∶10 000稀释酶标二抗及二抗37 ℃作用30 min效果最佳，因此试验选用1∶10 000来稀释酶标二抗，37 ℃下作用30 min。

敏感性、特异性与重复性是建立ELISA方法时必须要检测的项目，是ELISA方法能否成功建立的关键。笔者将阳性血清稀释25 600倍时，仍能检测为阳性，说明建立的ELISA敏感性高。该试验用阻断试验来反应ELISA的特异性，所用Eg95蛋白对阳性血清的阻断率在90%左右，说明Eg95蛋白能特异性阻断阳性血清，表明该ELISA方法的特异性强；该试验的批内及批间重复性试验表明变异系数均在2.24%～8.67%，均不超过10%，与张先锋、吴洋、王芳等建立的ELISA方法的重复性相符，说明建立的ELISA方法的重复性良好[10]。试剂盒保存期的长短是影响试剂盒产业化的重要因素之一,也是试剂盒能否过关的关键因素。该试验建立的间接ELISA试剂盒在4 ℃条件下保存6个月后，敏感性无变化，表明试剂盒在4 ℃条件下可以保存6个月，与其他ELISA商品化试剂盒的保存期相近。

该ELISA方法对45份二免后绵羊血清进行检测，结果均为阳性；对30份来自非疫区未免疫的健康绵羊血清进行检测，结果均为阴性。这说明该ELISA方法可用于细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。但是，由于目前还没有检测细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体的商品化试剂盒问世，所以笔者的建立ELISA方法还不能与其他ELISA检测方法相比。

参考文献

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中图分类号S859.79+5文献标识码A文章编号0517-6611(2015)30-105-04

基金项目重庆市农业科技成果转化资金项目(cstc2015jcsf-nycgzhA

作者简介邓灿新(1990- )，男，广西梧州人，硕士研究生，研究方向：动物病原生物学。 *通讯作者，曾仁权，教授，博士，硕士生导师，从事动物药物化学研究。*通讯作者，曹政，研究员，博士，从事微生物分子生物学研究。

收稿日期2015-08-31

The Development of the Indirect ELISA Test Kit forEchinococcusgranulosusAntibody

DENG Can-xin1,TIAN Dong-sheng1,LI Chun-yan2,ZENG Ren-quan1*,CAO Zheng2*et al (1.Department of Veterinary Medicine,Southwest University,Chongqing 402460; 2.Chongqing Auleon Biological Company Limited,Chongqing 402460)

Abstract[Objective] This study was designed to develop an indirect ELISA kit for detecting antibodies against Echinococcus granulosus using recombinant EG95 protein as antigen.[Method] Eg95 recombinant protein as antigen,determined the optimal reaction conditions and criterion of indirect ELISA,detection sensitivity,repeatability,detected its sensitivity and repeatability.[Result] The ELISA method is high specificity,sensitivity,accuracy(100%) and good repeatability.[Conclusion] This ELISA kit could be used to monitor the immune status of the echinococcosis Eg95 genetic engineering subunit vaccine.

Key wordsEchinococcus granulosus; Eg95 protein; Kit; ELISA