桦褐孔菌总三萜提取工艺的研究

戚月婷，玄光善

(青岛科技大学 药学系，山东 青岛 266042)

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又名桦树菇、西伯利亚灵芝，中文学名为白桦茸。在外文资料中，其学名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出现［1］。桦褐孔菌是一种极其珍贵的药用真菌，属多孔菌科褐卧孔菌属，是一种生长在寒带的木腐菌。桦褐孔菌菌核呈现瘤状、无柄，外表黑色或黑褐色，内部黄褐色，老后表面深裂，很硬，干时脆。野生桦褐孔菌生于白桦、银桦等树的活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上。桦褐孔菌主要分布在北纬45 ～50°的中国的黑龙江和吉林、波兰、芬兰、北美北部、俄罗斯、日本北海道等地。桦褐孔菌是俄罗斯及东欧地区一带的民间药用真菌，其有效成分已经引起美国、韩国、日本等国科学家的高度重视。俄罗斯认为，桦褐孔菌是上帝赐给苦难人类的礼物。日本的研究人员高度评价桦褐孔菌为“万能药”。美国则把桦褐孔菌列入“特殊的天然物质”，作为未来宇航员们的饮品。

随着对桦褐孔菌化学成分的研究日渐深入，大量活性成分被分离出来，包括多糖、三萜类化合物、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、栓菌酸、木质素类和黑色素类等200 多种化学成分。研究发现，桦褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增强机体免疫、防治艾滋病等多种药理作用［2］。三萜类化合物作为桦褐孔菌的一种主要活性成分，可用于恶性肿瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的预防和治疗［3］。研究发现，其主要有效成分为羊毛脂烷型四环三萜［4］。

三萜类化合物的结构比较复杂，而且性质不太稳定，温度太高会破坏其结构;难溶于水，易溶于有机溶剂。根据相似相容的原理，可选用极性相近的异丙醇作为提取溶剂［5］。超声波辅助提取法，作为一种新技术，是利用超声波产生的高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏药材细胞，促进溶剂渗透到药材细胞中，大大缩短了提取时间。此技术效率高、节省溶剂，尤其对植物细胞壁内活性物质的提取具有优势［6］。本实验采用超声辅助-回流提取法提取桦褐孔菌总三萜，以获得最佳提取工艺参数，为后续的纯化分离及工业化生产奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌，购于吉林长白山，干燥、粉碎、过40目筛后保存;齐墩果酸对照品(Sigma 公司，纯度＞98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、异丙醇等均为分析纯。

FW100 型高速万能粉碎机;HB-6 型磁力搅拌恒温水浴锅;RE-5 型旋转蒸发仪;KH-250DB 型数控超声波清洗器;UV762 型紫外-可见分光光度计。

1.2 实验方法

准确称取1.00 g 桦褐孔菌粉，按料液比1 ∶10 g/mL加入异丙醇，在90 Hz、50 ℃的条件下超声30 min，然后加热回流提取2 h。减压过滤，滤液旋蒸除去溶剂。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量测定。

1.3 分析方法

1.3.1 标准曲线的绘制 以齐敦果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法进行总三萜含量测定［7-8］。准确称取齐墩果酸标准品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶，用甲醇稀释至刻度，并摇匀，即得质量浓度为0.2 mg/mL 的标准品溶液。准确移取齐墩果酸标准品溶液0，0. 10，0. 20，0. 30，0. 40，0.50，0.60，0.70 mL，分别加入10 mL 具塞试管中，水浴挥尽溶剂，然后加入0.3 mL 新鲜配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸，60 ℃水浴中反应20 min，流水冷却至室温，加冰醋酸至10 mL，摇匀，在550 nm 波长处测定吸光值。以齐墩果酸质量x 为横坐标，吸光度y 为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。

图1 三萜类化合物标准曲线Fig.1 Standard curve of triterpenoids

由图1 可知，标准曲线的线性回归方程为y =3.524 6x－0.002 2，相关系数R2=0.999 2。结果表明，齐墩果酸在0 ～0.14 mg 范围内与吸光度线性关系良好。

1.3.2 含量测定 准确移取0.1 mL 提取液，水浴挥干，按照绘制标准曲线的操作方法测定样品在550 nm 波长时的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

三萜类化合物的定性分析采用氯仿-浓硫酸显色反应［9］，取一定量的桦褐孔菌异丙醇提取物，溶于氯仿，加入浓硫酸，氯仿层呈现红色，说明有三萜类化合物存在。将氯仿层点样在滤纸上，在254 nm的紫外分析仪下可以观察到绿色荧光现象，说明提取液中有三萜类化合物存在。

2.2 单因素实验

2.2.1 物料比对总三萜得率的影响 物料比对总三萜得率的影响，见图2。

图2 物料比对总三萜得率的影响Fig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids

由图2 可知，随着物料比逐渐增大，总三萜得率先增大后减小，在物料比为1∶10 g/mL 时，达到最大值。2.2.2 提取温度对总三萜得率的影响 提取温度对总三萜得率的影响，见图3。

图3 提取温度对总三萜得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids

由图3 可知，随着温度的不断升高，总三萜得率随之增加，70 ℃时，得率最高。在70 ～90 ℃的温度范围内，得率相对稳定。过高的温度会对三萜类化合物造成破坏。所以最佳提取温度选择80 ℃。

2.2.3 提取时间对总三萜得率的影响 提取时间对总三萜得率的影响，见图4。

图4 提取时间对总三萜得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids

由图4 可知，总三萜得率随提取时间的延长先增大后减小，2 h 时达到最大值。原因可能是，提取时间＞2 h 后，杂质也会被溶出到提取溶剂中。

2.2.4 提取次数对总三萜得率的影响 提取次数对总三萜得率的影响，见表1。

表1 提取次数对总三萜得率的影响Table 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids

由表1 可知，第一次提取的得率比较高，第二次及第三次的得率低很多。而且，多次提取会严重浪费时间和能源，也增加了后续浓缩工艺的难度。因此，提取1 次即可。

2.3 正交实验结果

在单因素实验的基础上，以总三萜得率为考察指标，采用L9(34)正交实验进行优化。因素水平见表2，结果见表3。

表2 正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交实验结果Table 3 The results of orthogonal test

由表3 可知，影响桦褐孔菌总三萜得率的因素程度大小依次为A ＞B ＞C，即物料比＞提取温度＞提取时间。最优组合为A2B3C3，即10 倍量异丙醇、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h。

考虑到提取时间对总三萜得率的影响最小，而且＞2 h 后，总三萜得率无明显增加，从节约时间和能源的角度考虑，工业化生产时可采用10 倍量异丙醇，提取温度80 ℃，提取时间2 h。

2.5 验证实验

为进一步考察最优提取工艺的稳定性，在该条件下，即物料比1∶10 g/mL、提取温度80 ℃、提取时间2 h，进行3 次重复实验，结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 The results of proof test

由表4 可知，平均得率为1.42%，相对标准偏差RSD 为2.14%，数据相对稳定，表明该最佳提取工艺合理可行。

3 结论

用异丙醇提取桦褐孔菌总三萜的最佳工艺为:料液比1∶10 g/mL，提取温度80 ℃，提取时间2 h。采用该提取工艺提取桦褐孔菌总三萜，其得率可达1.42%。

［1］ 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌［J］.中国食用菌，2002，21(4):7-8.

［2］ 李根培，朴惠善.桦褐孔菌化学成分与功能特性的研究进展［J］.中国食用菌，2010，29(4):3-4.

［3］ 张小青，戴玉成. 中国真菌志(锈革孔菌科)［M］. 北京:科学出版社，2005:92-93.

［4］ 麦勤勤，陈寅生，程丽红，等.桦褐孔菌中羊毛脂烷型三萜系列化合物的探讨［J］. 河南大学学报:医学版，2013，32(2):112-116.

［5］ 林庚申，张小青，魏铁铮，等.桦褐孔菌三萜类物质的提取与含量测定［J］.菌物学报，2007，26(3):396-403.

［6］ Vinatoru M.An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2001(8):303-313.

［7］ 黄书铭，杨新林，黄健，等.紫外分光光度法快速测定灵芝样品中三萜化合物的含量［J］.北京理工大学学报，2004，24(6):555-558.

［8］ 孙宏，张泽.分光光度法测定白桦三萜类物质总量［J］.南京林业大学学报:自然科学版，2005，29(1):110-112.

［9］ 吴立军. 天然药物化学［M］. 北京:人民卫生出版社，2009:287.