平菇菌种液体培养质量的影响因素分析*

范可章，陈 灵，张 振，蔡 健**

（1.阜阳师范学院生命科学学院，安徽 阜阳 236037；2.阜阳市宁老庄高级职业中学，安徽 阜阳 236036）

〈栽培技术〉

平菇菌种液体培养质量的影响因素分析*

范可章1，陈 灵2，张 振2，蔡 健1**

（1.阜阳师范学院生命科学学院，安徽 阜阳 236037；2.阜阳市宁老庄高级职业中学，安徽 阜阳 236036）

为了解平菇菌种液体培养中各种因素对培养质量的影响，以黑平209为试验材料，以检测单位体积发酵液菌丝体干重及其蛋白含量为判断依据。采用不同性质的碳源、氮源及无机盐分别对本底培养基进行调整形成新的培养基，进行发酵试验并检测，同时采用正交实验进行比较。结果表明平菇液体培养，葡萄糖为最佳碳源，蔗糖与红糖稍次，麦芽糖与乳糖表现最差；酵母浸出粉为最佳氮源，玉米粉最次；无机盐表现出影响小，彼此间差异不明显。单因素分析和正交实验确定了酵母浸出粉、葡萄糖、MgSO4、K2HPO4的最佳用量。蛋白质含量最高的培养基配方是酵母浸出粉2%、葡萄糖4%、MgSO40.15%、K2HPO40.05%。

平菇；菌种；液体培养；因素分析

自从Hunfeid[1]最早报道四孢蘑菇（Agaricus campesriss）的菌丝能够进行液体培养以来，有多种食（药）用真菌菌丝液体发酵获得了成功。当前，国际上食用菌制种行业已走上产业化、专业化、工厂化大规模生产的道路，液体菌种具有培养时间短、发菌快、菌龄整齐、接种方便等优点，且有利于食用菌规模化、周年化、工厂化生产，使其越来越受到食用菌生产企业的青睐，已成为食用菌制种产业的发展趋势[2]。平菇（Pleurotus ostreatus）是我国栽培最广泛的食用菌之一，产量占全国食用菌总产量的40%左右[3]。平菇不仅具有很高的营养和医疗保健价值[4]，而且在生物修复和废弃物生物转化等领域也有重要作用[5]。目前平菇栽培主要采用固体菌种，菌种生产周期较长且质量不稳定。平菇液体菌种发酵研究也有一些[6-7]，但还不深入。如何提高平菇液体菌种的质量，需要搞清其影响因素，本研究采用不同营养源组合培养基进行平菇液体发酵，并分析蛋白质含量来判别菌丝体质量，分析不同因子对菌丝体的影响，以便为将来大规模生产优质平菇液体菌种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1主要材料

平菇菌种黑平209来自阜阳师范学院微生物实验室。母种斜面培养基为PDA培养基，本底液体摇瓶菌种培养基配方参考文献 [8]，具体为葡萄糖4%、蛋白胨1%、NaCl 0.25%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。培养基在微生物实验室自制，马铃薯购自农贸市场，其它化学试剂取自微生物实验室药品柜。HZQF160往复式恒温振荡器购自哈尔滨东联电子技术有限公司，TGL-16C型离心机购自上海安亭科学仪器厂，PHS-3B精密pH计购自上海精密科学仪器有限公司，LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌锅购自上海核子仪器厂，电热恒温水浴锅均购自合肥科隆公司。FA2104电子天平、凯氏定氮仪、超净工作台、生化培养箱、电热鼓风干燥箱等。

1.2方法

1.2.1 时间地点

2013年11月～2014年3月在阜阳师范学院微生物实验室进行试验。

1.2.2 菌种准备

从实验室栽培平菇中选取生长健壮、株型特征明显的子实体，在超净工作台运用组织分离法分离出菌柄菌盖结合处的洁白菌肉，接种于已制好并灭菌的PDA斜面培养基上，放置在恒温培养箱中，25℃避光培养至菌丝长满斜面。

液体菌种的制作：将PDA斜面上的菌种接种到本底液体培养基中，500 mL摇瓶内装入120 mL本底培养液，高压灭菌后冷至25℃左右，接入4块0.5 cm2的等量斜面平菇菌块，使气生菌丝一面向上悬浮，置于培养箱内，25℃静置培养24 h。然后将摇瓶置于往复式恒温振荡器内，25℃、121 r·min-1震荡培养7 d[8-9]。

1.2.3 试验设计

将本底摇瓶培养液配方中的碳源葡萄糖分别用蔗糖、红糖、乳糖和麦芽糖以相应浓度替换配制，连同本底共5种配方，500 mL摇瓶装液量为120 mL培养液，每种设3次重复。高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20 min，接种量为摇匀的菌丝分布一致的液体菌种10 mL。25℃、121 r·min-1振荡培养7 d。定量过滤，用双蒸水洗涤3次，45℃烘干至恒重，称重[10]。凯氏定氮法测定相应培养基配方中菌丝体蛋白含量。与碳源替换配制类似，将酵母浸出粉、黄豆粉、蚕蛹粉和玉米粉作为氮源成分，分别代替本底配方中的蛋白胨，为增加效果显著性，含量都按2%的浓度配制，培养检测同上。

无机盐的影响效果较难确定，因食用菌生长要求的无机盐不止一种，为既能保证食用菌菌丝的生长，又能明显地表现出相应无机盐影响的效果，特使原配方中无机盐含量不变，再分别按照0.1%的含量标准加入KCl、KH2PO4、K2HPO4、NaCl和MgSO4·7H2O，配制成5种新的配方，按前法灭菌、接种、培养和检测。

1.2.4 优化培养基的筛选方法

根据检测结果，选取效果最优碳源、氮源、无机盐设计四因子、三水平的L9（34） 正交试验，选定平菇最适培养基组成，设3次重复[11]。

2 结果与分析

2.1不同碳源对菌丝蛋白质含量的影响

不同碳源对菌丝蛋白质含量的影响见图1。

由图1可见，使用不同性质的糖作碳源培养的菌丝体蛋白质含量有差异，相对优劣的排列次序为：葡萄糖＞红糖＞蔗糖＞乳糖＞麦芽糖。可见平菇适合以葡萄糖作为碳源，经过方差分析，葡萄糖、红糖和蔗糖培养基所测蛋白质含量结果之间差异不明显（P＞0.05），说明红糖和蔗糖也较易为平菇吸收利用，只是稍次于葡萄糖。乳糖和麦芽糖类似，但与葡萄糖、红糖、蔗糖差异显著（P＜0.05），说明平菇利用乳糖或麦芽糖相对困难。所以，本试验中葡萄糖为最佳碳源。

2.2不同氮源对培养菌丝体中蛋白质含量的影响

不同氮源对培养菌丝体中蛋白质含量的影响见图2。

图1 不同碳源培养菌丝体中蛋白质含量Fig.1 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different carbon sources level

图2 不同氮源培养菌丝体中蛋白质的含量Fig.2 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different nitrogen sources level

图2表明，不同性质的氮源对平菇菌丝体蛋白质含量影响较明显，效果优劣次序为酵母浸出粉＞蛋白胨＞黄豆粉＞蚕蛹粉＞玉米粉。酵母浸出粉、蛋白胨和黄豆粉之间差异不显著（P＞0.05），所以这三种成分经常用来作为平菇培养的氮源，这三种物质与蚕蛹粉比较差异显著（P＜0.05），与玉米粉比较差异极显著（P＜0.01），蚕蛹粉与玉米粉间的差异也表现出显著水平，这说明蚕蛹粉作为平菇培养的氮源效果并不好，玉米粉作为氮源也不适合，因其含大量淀粉，作为碳源使用可能更好，但应以试验为依据。本试验中酵母浸出粉为最佳氮源。

2.3不同无机盐含量变化对培养菌丝体蛋白质含量的影响

不同无机盐含量变化对培养菌丝体蛋白质含量的影响见图3。

图3 不同无机盐培养菌丝体中蛋白质的含量Fig.3 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different inorganic salt level

由图3可见，在本底培养液中加入相同比例的不同无机盐时，测定蛋白质含量，优劣次序排列为MgSO4＞K2HPO4＞KH2PO4＞KCl＞NaCl；经分析发现各无机盐间差异不显著，表明在本试验中无机盐对平菇菌丝体蛋白质含量的影响小，这一点估计是与试验设计有关，如何既能让菌丝满足生长时无机盐供应，又能表现出影响因子的效果，的确需要进一步的方法研究。在略微差异的情况下，本试验得出MgSO4和K2HPO4为最佳无机盐。

2.4平菇液体培养基最佳配方的筛选

选取本实验中最佳碳源葡萄糖，最佳氮源酵母浸出粉，最佳无机盐MgSO4、K2HPO4为供试因子，设置正交实验，见表1。

表1 正交实验因素及水平Tab.1 The factor and level of orthogonal test

2.5平菇液体培养基最佳配方的确定

平菇液体培养基最佳配方的确定见表2。

由表2可以看出，A的极差极大，其次是B、C、D。即对蛋白质含量影响最大的因子是酵母浸出粉，其次是葡萄糖、MgSO4、K2HPO4。为了进一步考察各因子对指标的影响，进行了完全随机模型方差分析，见表3。在99%置信度下，A对指标的影响是显著的（P＜0.05）。由表2可得所测蛋白质含量最高的培养基配比是A2B2C3D1，即酵母浸出粉2%、葡糖糖4%、MgSO40.15%、K2HPO40.05%。

3 讨论

平菇属于木腐菌，分解有机质的能力较强，自然界适于其生长的秸秆及木质材料较为广泛。该试验表明，不同碳源、氮源对平菇生长的质量有明显影响。这就提醒了某种食用菌在某种有机质中能够生长，并不能说明这种有机质就非常适合其生长，反过来说，要发挥食用菌的最佳生长能力，还必须非常清楚地了解其最佳生长要求，只有选择对其生长最有利的碳源、氮源，才能实现最佳生长。

表2 L9(34)正交实验结果Tab.2 The results of L9(34)orthogonal test

表3 正交设计方差分析表（完全随机型）Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment(total random model)

菌丝的发酵生长具有典型的逻辑斯蒂（Logistic）规律[3]。在本试验初期摇瓶培养中，菌丝生长比较缓慢，培养3 d～5 d菌丝球增长旺盛，6 d～7 d菌丝球数量达到顶峰。随着培养液中营养成分的减少，菌丝活性开始减弱，生长速度开始下降。秦俊哲等[12]的研究表明，食用菌菌丝液体发酵7 d后，菌丝球的自溶开始加快，培养液变的浑浊。所以，本试验的数据检测都是在培养至第7天进行。

无机盐是食用菌生长发育过程中必需物质，但在本试验中，添加不同无机盐的效果相比较差异不明显，分析原因，可能是无机盐属微量调节因子，食用菌对无机盐的需要量少，加之不同无机盐的添加是在本底培养基的基础上进行的，原培养基中的无机盐并不缺乏，碳源和氮源中也可能含有一定量的无机盐。可见试验中的不明显差异只可能是不同无机盐浓度变化造成的，在一定程度上反映了它们的影响效果。在最佳配方的筛选中，只利用了影响效果最明显的2个无机盐，这在满足食用菌全面生理需求上是有缺陷的，有研究表明[13]，钠盐和钙盐也是食用菌生长必不可少的，可见，即使试验中影响效果小也不应该缺乏，至于最佳添加量，还有待试验研究。鉴于各因素间还存在相互制约，碳源和氮源的比例也会发生变化。本试验的最佳配方只有一定的参考意义。

食用菌的液态深层培养可以实现菌丝体的快速生产，通过优化生产条件，可以提高其生物活性物质的含量[14]。本试验表明，平菇液体发酵的优化，不仅可快速生产优质平菇菌种，还可以为人们提供大量液态发酵的平菇蛋白质，有利于改善人们的膳食结构。

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Analysis of Influencing Factors on the Quality of Oyster Mushroom’s Hypha in Liquid Culture Medium

FAN Ke-zhang1,CHEN Ling2,ZHANG Zhen2,CAI Jian1
(1.School of Life Science,Fuyang Teachers College,Fuyang 236041,China; 2.Advanced Professional High School of Ninglaozhuang,Fuyang 236036,China)

In order to know the factors which was more implications in the oyster mushroom’s liquid culture medium,and conveient for confirming key concern factors in practice,the test was carryed on especially.Using the black oyster mushroom 209 as the test material,the quality of mushroom growth by measuring the dry weight and the protein content of its hypha per unit were determined.Diffient properties of carbon source,nitrogen source and mineral salt were used to adjust the relevant material in the background medium and to form the new mediums.The fermentation test were carried on to measure the informations.On the same time,the orthogonal test was done to compare the diverse.In oyster mushroom’s liquid culture medium,glucose was the best carbon source,followed by sucrose and brown sugar,and maltose and lactose were the worst in this test.Powder of yeast extracts was the best nitrogen source,and corn flour was the worst.Mineral salts had no obvious difference between each other.The best use level of yeast extracts,glucose,magnesium sulfate and dipotassium phosphate were determined by single factor analysis and orthogonal test.The formula of the culture medium which can produce the most protein content was powder of yeast extracts 2%,glucose 4%,magnesium sulfate 0.15%,dipotassium phosphate 0.05%.

oyster mushroom;strain;liquid culture medium;factor analysis

A

1003-8310（2015）04-0021-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.005

安徽省教育厅自然科学项目（KJ2013B197）；安徽省高校自然科学基金重点项目（KJ2014A194）。

范可章（1970-），男，硕士，讲师，主要从事食用菌栽培的教学与研究工作。E-mail:fankezhang@126.com

**通信作者：蔡健 (1965-)，男，博士，教授，主要从事植物生物技术研究工作。E-mail:fycaijian@163.com

2015-05-02