番茄和茄子RKNIF2基因的鉴定和特征分析

刘文宝　王清华　张敏　赵晓翠　张卫华　王秀峰

摘要：CaRKNIF2是辣椒中受根结线虫等多种生物逆境诱导表达的WRKY基因，但在我国重要的蔬菜作物番茄和茄子中缺乏相关研究。对蔬菜抗根结线虫基因的鉴定和功能分析是进行蔬菜抗线虫分子育种的基础。本研究利用比较基因组学的方法，从番茄和茄子的基因组中鉴定出与CaRKNIF2直系同源的基因，并对其基因结构、系统进化、编码蛋白的基序以及顺式调控元件进行了系统分析，为深入解析番茄和茄子RKNIF2的功能提供了有益启示。

关键词：番茄；茄子；根结线虫；RKNIF2；特征

中图分类号：S641.201+S641.101

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2015）10-0013-04

根结线虫（Meloidogyne spp.）是一种固着性内寄生植物线虫，其分布广泛且寄主种类繁多，是威胁蔬菜生产的主要病原物之一，也是导致蔬菜连作障碍的重要原因。根结线虫不仅危害植株根部，破坏根组织的分化和生理活动，影响地上部分生长发育，同时还会加重枯萎病、根腐病等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。选育抗根结线虫蔬菜品种对于蔬菜产业可持续发展和保护环境、保障食品安全具有重要意义，而这有赖于蔬菜根结线虫抗性基因的挖掘和抗性机理的研究。目前，蔬菜根结线虫病的研究日益受到人们的重视，包括病原线虫的分离鉴定和分子生物学研究、病原线虫与寄主植物的互作、蔬菜抗根结线虫基因的筛选克隆和分子标记研究、蔬菜抗根结线虫基因工程以及蔬菜根结线虫防控技术等的报道越来越多。

WRKY是一类含有由约60个氨基酸残基组成的WRKY结构域的转录因子，在植物生长发育和防卫应答中具有重要功能。研究表明，WRKY基因为番茄Mi-1介导的根结线虫抗性表达所必需；而在拟南芥和黄瓜中也发现多个WRKY基因受根结线虫调控表达；另外，拟南芥中AtWRKY23为甜菜孢囊线虫取食点的建立所必需，而AtWRKY6等的下调表达对根结线虫的发育有重要影响。这说明植物WRKY基因在根结线虫抗性应答过程中具有重要功能，值得深入探讨。我国对于重要蔬菜作物番茄（Solanum lycopersicum）和茄子（Solanum melongena）有关WRKY基因与根结线虫抗性的研究还很少。番茄和茄子基因组测序工作的完成为从基因组中鉴定和解析重要功能基因提供了便利。本研究利用比较基因组学的方法，从番茄和茄子基因组中各鉴定出一个与辣椒根结线虫抗性应答基因CaRKNIF2同源的WRKY基因SlRKNIF2和SmRKNIF2，并对其基因结构、遗传进化、蛋白基序和顺式作用元件进行了系统分析，为下一步解析SlRKNIF2和SmRKNIF2的功能提供了线索。

1研究方法

利用辣椒的CaRKNIF2基因序列做诱饵来搜索茄子基因组数据库（http：//eggplant.kazusa.or.jp/blast.html）和NCBI数据库（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome），鉴定番茄和茄子的RKNIF2基因。利用Mega 4.1软件对SlRKNIF2和SmRKNIF2及其同源序列进行系统进化分析，并将其编码蛋白与CaRKNIF2基因的编码蛋白进行比较分析。利用motif-Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）对SlRKNIF2和SmRKNIF2的编码蛋白进行结构域和基序分析。利用RKNIF2编码区和基因组序列在线显示基因外显子和内含子的组成（http：//gsdsl.cbi.pku.edu.cn/chinese.php）。根据编码区序列和其所在scaffold序列得到SlRKNIF2和SmRKNIF2基因起始密码子ATG上游1500bp的序列，利用PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对启动子区的顺式作用元件进行预测分析。利用WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）对SlRKNIF2和SmRKNIF2基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测。

2结果与分析

2.1SlRKNIF2和SmRKNIF2的鉴定及分子特征

利用比较基因组学的方法从番茄和茄子基因组中各鉴定出一个与辣椒RKNIF2直系同源的基因，分别命名为SIRKNIF2和SmRKNIF2（表1）。分析发现，它们的基因组序列都含有6个外显子，且这6个外显子的大小相似、排列一致（图1）。SlRKNIF2和SmRKNIF2编码区长度分别为1650bp和1605bp，预测编码的蛋白都含有一个由61个氨基酸残基组成的WRKY结构域、一个Ⅱ类几丁质结合结构域、一个甲基-CpG结合结构域、3～4个糖基化位点、6～7个豆蔻酰化位点，此外，SmRKNIF2编码的蛋白还含有一个谷氨酰胺富集区（表2）。亚细胞定位预测显示，SlRKNIF2和SmRKNIF2编码的蛋白定位在细胞核中（表1），这与CaRKNIF2编码蛋白定位的结果一致。

2.2SlRKNIF2和SmRKNIF2的系统进化分析及序列比对

由图2可知，SlRKNIF2和SmRKNIF2与CaRKNIF2基因在进化上同属一个类群。序列比对发现，SlRKNIF2和SmRKNIF2的编码蛋白与CaRKNIF2编码蛋白的序列一致性分别为86.45%和83.87%，其WRKY结构域只有一个氨基酸残基的差异，序列一致性均为98.36%；SlRKNIF2和SmRKNIF2编码蛋白的序列一致性为85.23%，其WRKY结构域的序列一致性为100%，说明它们在结构上非常保守，可能具有相似的功能。endprint

2.3SlRKNIF2和SmRKNIF2顺式作用元件分析及功能预测

转录水平的调控是植物表达调控的主要步骤，基因上游序列顺式作用元件的分析可为研究基因的表达和功能提供重要线索。分析发现，在SlRKNIF2和SmRKNIF2的上游序列中存在多个顺式作用元件，可应答多种激素和非生物逆境（表3）。其中，两基因均含有的元件有脱落酸应答元件ABRE、真菌激发子应答元件Box-W1、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、热胁迫应答元件HSE、低温应答元件LTR、伤害和病原物应答元件W-box，但其数目在两基因中不尽相同；另外，SlRKNIF2上游序列中含有一个干旱诱导元件MBs和一个赤霉素应答元件P-box，而SmRKNIF2上游序列中含有两个病原物和防卫应答元件TC-rich repeats和两个水杨酸应答元件TCA-element。

对CaRKNIF2的研究表明，TMV、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信号分子水杨酸能快速而显著地诱导CaRKNIF2的表达，茉莉酸甲酯能抑制它的表达，且CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调，在根尖组织中表达量最高；CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株接种非毒性南方根结线虫后根部卵块数明显增加，说明CaRKNIF2基因在植物根结线虫抗性应答过程中具有一定功能。根据序列比对和顺式元件分析的结果，推测SlRKNIF2和SmRKNIF2基因可能具有与CaRKNIF2相似的功能。

3讨论与结论

根结线虫特别是南方根结线虫因其寄主范围广，危害严重，已成为蔬菜可持续发展的主要障碍之一。加强蔬菜根结线虫抗性机制的研究，可为抗线虫蔬菜分子育种提供优异的目的基因和分子标记，是解决蔬菜生产中线虫危害的有效手段。本研究从番茄和茄子基因组中解析的RKNIF2基因与辣椒的CaRKNIF2基因直系同源，它们在进化上同属一个类群，都含有6个外显子，其编码的蛋白都含有一个保守的WRKY结构域，其上游序列中存在多个应答不同逆境和激素的顺式调控元件，暗示它们可能具有多样的生物学功能。虽然番茄、茄子和辣椒的RKNIF2基因结构非常保守，编码蛋白的序列一致性也非常高，但是在WRKY结构域内，番茄和茄子与辣椒存在一个氨基酸残基的差异，这种差异是否会影响基因的功能需要进一步研究。另外，番茄和茄子RKNIF2基因在顺式调控元件上存在较大差异，其编码蛋白基序也有一定差异，这种差异对茄科不同物种RKNIF2的表达和功能有何影响，是下一步研究需要解决的重要问题。endprint