1株溶磷细菌P0417的溶磷机制

管国强　李倩　季蓉蓉　陈菊　钱静亚　黄达明

摘要：以Ca3（PO4）2为磷源，研究溶磷细菌伯克霍尔德氏菌P0417产生的有机酸和磷酸酶对其溶磷效果的影响，探讨溶磷细菌P0417的溶磷机制。结果发现，溶磷细菌P0417液体摇瓶培养5 d后，溶磷量达503.53 μg/mL；溶磷细菌P0417产生的有机酸包括草酸、酒石酸、苹果酸、丙酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸，浓度总量达420.59 mg/L；有机酸的溶磷量为493.89 μg/mL，磷酸酶粗酶液的溶磷量为18.37 μg/mL。结果表明，溶磷细菌P0417的溶磷机制主要是通过分泌有机酸进行溶磷的。

关键词：溶磷细菌；机制；有机酸；磷酸酶

中图分类号： Q935 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0432-03

磷在农业中起重要的作用，但也是农业生产中重要的限制因素之一。磷在土壤中的存在形式主要以难溶性磷酸盐为主，不易被作物吸收，因此无法满足一般作物的生长需求。在碱性土壤中，难溶性磷盐主要为Ca3（PO4）2，酸性土壤中主要的磷盐为FePO4、AlPO4[1-2]。土壤中的一些微生物具有溶解难溶性磷酸盐的活性，主要包括细菌、真菌、放线菌等[3]。不同的微生物溶磷能力有较大的差异，其溶磷量在1421～643.2 μg/mL之间[4-6]。土壤溶磷微生物不仅可以提高植物对磷的利用效率，改善植物营养条件，增加抗病能力[7]；而且还可以改善土壤结构，提高有机质含量，改良盐碱地，对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要的作用[8]。

有关溶磷微生物的研究和应用已有多年，但其溶磷机理还不十分清楚，从而极大地限制了溶磷微生物的生产应用[9]。笔者所在的课题组前期已经从桂花树根际土壤中筛选出1株具有溶磷功能的细菌，经鉴定为德克霍尔德氏菌P0417，本研究从该溶磷菌对Ca3（PO4）2的溶磷作用出发，探讨溶磷菌产生的有机酸和磷酸酶对溶磷量的影响，完善溶磷菌的溶磷机理，为提高溶磷菌对难溶性磷的利用效率、开发溶磷微生物肥料等提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌株P0417由笔者所在的实验室自行筛选，鉴定为德克霍尔德氏菌。

1.2 培养基

PKO培养基：10 g Ca3（PO4）2，10 g葡萄糖，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g NaCl，0.3 g KCl，0.03 g FeSO4·7H2O，0.03 g MnSO4·4H2O，0.5 g （NH4）2SO4，pH值7.0～7.2，1 000 mL水。Ca3（PO4）2单独灭菌后加入。

1.3 主要试剂及配制方法

供液相分析用有关试剂均为分析纯，流动相水为娃哈哈纯净水。

供液相分析用标准样品的配制：0.01 mg/mL酒石酸，0.1 mg/mL 草酸，0.005 mg/mL苹果酸，0.02 mg/mL柠檬酸，0.000 5 mg/mL乙酸，0.01 mg/mL丙酸，0.002 5 mg/mL琥珀酸。

改进的通用缓冲试剂（MUB）储备液的配制：12.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），11.6 g顺丁烯二酸，7 g柠檬酸和6.3 g硼酸于488 mL 1 mol/L NaOH溶液中，用水稀释至1 L，储存于冰箱中。

改进的通用缓冲试剂（MUB）的配制：取200 mL MUB储存液于500 mL烧杯中，用0.1 mol/L HCl滴定到溶液中使pH值为6.5，再用水定容至1 L。用0.1 mol/L NaOH滴定另一份200 mL MUB储备液使其pH值为11，然后用水定容至1 L。

0.025 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液的配制：溶解 0.630 g 对硝基苯磷酸二钠于40 mL改进的通用缓冲液中，缓冲液pH值为6.5时用于检测酸性磷酸酶，pH值为11时用于检测碱性磷酸酶，用相同pH值的MUB储备液将溶液稀释到50 mL，放置冰箱中，现配现用。

1.4 有机酸的测定

液相色谱分离条件：色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm）；流动相为0.02 mol/L KH2PO4缓冲溶液—甲醇溶液（98% ∶ 1%），用1 mol/L磷酸调节pH值至2.6，紫外检测波长210 nm；进样量10 μL，流速0.5 mL/min，柱温为室温。

1.4.1 有机酸标准品的定性定量测定 将7种有机酸标准品按上述色谱分离条件在高效液相色谱上样，分别得出其出峰时间。并将不同浓度的有机酸标准液进样，以峰面积为纵坐标，以有机酸浓度作为横坐标绘制标准曲线对其定量分析。

1.4.2 发酵液中有机酸的定性定量测定 将菌株用LB液体培养基制成菌悬液（浓度约为10 亿个/mL，即波长600 nm，D值1.0），按菌悬液与PKO液体培养基比例为 1 ∶ 100 接种，即每100 mL培养基接菌悬液1 mL，以不接菌空白PKO液体培养基为对照，在28 ℃、150 r/min条件下摇床培养120 h。取发酵液2 mL，10 000 r/min离心，再经0.22 μm滤膜真空抽滤后上液相色谱，将其图谱与标准样品图谱进行比对。

1.4.3 有机酸对磷酸钙的溶解作用 人工模拟配制菌株P0417发酵产生的有机酸，即向与发酵液相同浓度的有机酸混合溶液加入与培养基同质量的Ca3（PO4）2于三角瓶中，与接菌的培养基在相同条件下培养120 h，做3组平行试验，以不加有机酸溶液为空白对照组，测定溶磷量[10-11]。

1.5 磷酸酶活性测定

1.5.1 发酵液中磷酸酶活性的测定[12] 标准曲线的绘制：取6支试管，依次吸取l g/L标准对硝基酚溶液0、1、2、3、4、5 mL 分别装于试管中，用无菌水定容至5 mL，在每个试管中再加入1 mL 0.5 mol/L氯化钙和4 mL 0.5 mol/L氢氧化钠，振荡后过滤，测定420 nm条件下滤液吸光度。以1 h 1 L发酵液中作用于底物并释放出产物的微摩尔数称为1个酶活力单位，记为μmol/（L·h）。endprint

吸取1 mL发酵液，加入4 mL pH值为6.5的MUB，再加l mL 0.025 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液，振荡几秒钟。塞住瓶塞，37 ℃条件下培养l h后，加入1 mL 0.5 mol/L氯化钙和4 mL 0.5 mol/L氢氧化钠，振荡后用折叠滤纸过滤悬液。将澄清滤液在420 nm比色。此为酸性磷酸酶活性测定方法，碱性磷酸酶时所用MUB试剂pH值为11。

1.5.2 发酵液中磷酸酶对磷酸钙的溶解作用

1.5.2.1 磷酸酶粗酶液的制备及分离纯化 按“1.4.2”节的方法接菌振荡培养72 h，并参照黄毅等的方法[13-14]略加修改，取发酵液过滤后滤液在4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液；向其中加入硫酸铵至40%饱和度，4 ℃静置3 h后，4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min，收集上清液；再向其加入硫酸铵至70%饱和度，4 ℃条件下盐析3 h后，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心30 min，收集沉淀；沉淀用含0.5 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-Hcl 缓冲液（pH值为8.6）溶解后超滤，虑管通过离心力使有机酸等小分子通过，大分子蛋白截留得到粗酶液。

1.5.2.2 粗酶液对磷酸钙的溶解作用 加入1%磷酸钙到粗酶液中，测定溶磷量。

2 结果与分析

2.1 溶磷细菌分泌产生的有机酸的种类及其溶磷效果

2.1.1 有机酸标准品的高效液相色谱图 7种有机酸的出峰时间分别是草酸5.201 min，酒石酸6.420 min，苹果酸8510 min，丙酸10.486 min，乙酸11.301 min，柠檬酸 15.250 min，琥珀酸18.445 min（图1）。

2.1.2 发酵液中有机酸的色谱图 与标准样品色谱图的出峰时间进行比对后，发现不接菌空白样品的色谱图中只有草酸、酒石酸、苹果酸和乙酸存在，且含量较少，未见丙酸、柠檬酸和琥珀酸。而接菌的样品发酵液色谱图中7种有机酸均存在，而且草酸的含量明显增高（图2、图3）。

2.1.3 菌株产有机酸的质量浓度 分别将不同浓度的有机酸标准液进样，以峰面积为纵坐标，以有机酸浓度作为横坐标绘制标准曲线（表1），通过比对相应有机酸标准曲线得到该样品产有机酸的浓度（表2）。

菌株P0417的发酵液中，不仅有机酸的种类增多，而且含量也增加。发酵液中有机酸的浓度最终可达420.59 mg/L，约是空白对照组的10倍，其中草酸和琥珀酸的增加量最多（表2）。

2.1.4 有机酸对磷酸钙的溶解作用 在不接溶磷菌条件下，向培养基中加入同种浓度的7种有机酸混合液，得出7种有机酸混合液的溶磷量是493.89 μg/mL，而溶磷菌P0417的溶磷量为503.53 μg/mL（表3），说明溶磷菌的溶磷作用可能存在多种机制，而有机酸的螯合作用是溶磷菌P0417溶磷的主要途径。

2.2 溶磷细菌分泌产生的磷酸酶活性及其溶磷效果

2.2.1 发酵液中磷酸酶活性的测定 在相同条件下同时测定120 h内发酵液中酸性磷酸酶活力的变化和碱性磷酸酶活力的变化，发现酸性磷酸酶活力随时间变化而不断变化，且在72 h时达到最高，达2 186 μmol/（L·h），碱性磷酸酶活性也随时间变化，且在72 h时达到最高，为2 571 μmol/（L·h） 。此外，在以磷酸钙为单一磷源的培养基中，碱性磷酸酶的活力明显高于酸性磷酸酶的活力（图4）。

2.2.2 发酵液中磷酸酶对磷酸钙的溶解作用 提取溶磷细菌P0417代谢产生的磷酸酶粗酶液，加入一定量磷酸钙反应后测其溶磷量为18.37 μg/mL。说明磷酸酶也会产生一定的溶磷效果，但这种作用不是溶磷菌产生溶磷作用的主要原因。

3 结论与讨论

20世纪初，人们就开始研究土壤微生物与磷转化之间的关系，利用土壤溶磷菌降解土壤中丰富的难溶性磷源具有广阔的应用前景。目前，有关溶磷的研究多集中在菌株筛选及应用效果等方面，有关溶磷机制的研究仍比较薄弱，樊磊等认为微生物对土壤溶磷的机理涉及有机酸、质子和酶解等作用[15]。关于有机酸溶磷的观点认为，在微生物代谢过程中分泌的各种小分子量有机酸能与复合磷酸盐中的钙、铁和铝螯合释放出磷酸根形成稳定的可溶性复合物而被植物体吸收利用[16]。关于质子溶磷的观点认为，微生物在代谢活动中产生大量的质子可以与磷酸盐发生交换，使酸度提高，从而使磷矿粉溶解[17]。关于磷酸酶溶磷的观点是指，溶磷微生物分泌的磷酸酶能够溶解无机难溶磷[18]。也有研究报道有的菌株同时存在这几种溶磷机制[19]。Narsian等认为溶磷的最主要原因是溶磷微生物能够产生大量的有机酸及磷酸酶等[20]。

本试验对溶磷微生物分泌的有机酸及产生的磷酸酶进行了研究。通过液相色谱对发酵液分析后得出该微生物产生了草酸、酒石酸、苹果酸、丙酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等多种有机酸，总浓度达420.59 mg/L，其中草酸和琥珀酸的分泌量最多。有机酸对Ca3（PO4）2的溶解量为493.89 μg/mL，而溶磷菌的溶磷量为503.53 μg/mL，说明该微生物的溶磷作用主要来源于有机酸的分泌，这与Agnihotri的研究结果[21]基本一致。这些酸一方面使培养液的pH值下降，另一方面还与Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等离子以多种形式结合，使难溶性磷释放出来[22]。溶磷过程中磷酸酶的活力随时间的变化先增强后减弱又增强，说明磷酸酶活力与溶磷量无关，Patgiri等的研究结果也表明高效溶磷菌株的溶磷量与磷酸酶的活力无关，而与蛋白质的分泌量有关[23]。提取发酵粗酶液进行溶磷效果分析时发现，微生物分泌的磷酸酶也具有一定的溶磷效果，但溶磷量只有18.37 μg/mL。因此，在溶磷菌的溶磷作用中，溶磷菌分泌的有机酸主要起溶磷作用。endprint

在细菌P0417代谢过程中，草酸和琥珀酸的浓度相对较高，但菌体溶磷作用是否与这2种酸的产生有关需要进行进一步研究。Deubel等指出，溶磷细菌分泌的有机酸种类和数量并不是一成不变的，随着外界碳源的改变，培养液中有机酸种类和含量都会发生变化[24]，今后有必要在这方面开展深入研究。

参考文献：

[1]伊 鋆. 高效解磷细菌的筛选及解磷机理的研究[D]. 大连：大连理工大学，2011.

[2]Chung H，Park M，Madhaiyan M，et al. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea[J]. Soil Biology and Biochemistry，2005，37（10）：1970-1974.

[3]陈华癸撰. 土壤微生物学[M]. 北京：商务印书馆，1950：225-228.

[4]金术超，杜春梅，平文祥，等. 解磷微生物的研究进展[J]. 微生物学杂志，2006，26（2）：73-78.

[5]赵小蓉，林启美. 微生物解磷的研究进展[J]. 土壤肥料，2001（3）：7-11.

[6]何玉龙，周青平. 解磷微生物研究进展[J]. 青海畜牧兽医杂志，2012，42（2）：36-38.

[7]张宝贵，李贵桐. 土壤生物在土壤磷有效化中的作用[J]. 土壤学报，1998，35（1）：104-111.

[8]冯月红，姚 拓，龙瑞军. 土壤解磷菌研究进展[J]. 草原与草坪，2003（1）：3-7.

[9]王莉晶，高晓蓉，孙嘉怡，等. 土壤解磷微生物作用机理及解磷菌肥对作物生长的影响[J]. 安徽农业科学，2008，36（14）：5948-5950，5958.

[10]虞伟斌，杨兴明，沈其荣，等. K3解磷菌的解磷机理及其对缓冲容量的响应[J]. 植物营养与肥料学报，2010，16（2）：354-361.

[11]贺梦醒，高 毅，胡正雪，等. 解磷菌株B25的筛选、鉴定及其解磷能力[J]. 应用生态学报，2012，23（1）：235-239.

[12]钟传青. 解磷微生物溶解磷矿粉和土壤难溶磷的特性及其溶磷方式研究[D]. 南京：南京农业大学，2004.

[13]黄 毅，徐榕敏，江信红，等. 黄鳝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究[J]. 水生生物学报，2005，29（3）：323-328.

[14]孙 芳，任美凤，胡瑞斌，等. 韭菜酸性磷酸酶的分离纯化及酶学性质[J]. 食品科学，2013，34（17）：187-191.

[15]Bopaiah B M. Occurrence of phosphate solubilizing microorganisms in the root region of arecanut palms[J]. Plantation Crops，1985，13（1）：60-62.

[16]Li X L，George E，Marschner H. Extention of the phosphorous depletion zone in a VA-myeorrhizal white clover in a calcareous soil[J]. Plant and Soil，1991，136：41-48.

[17]Illmer P，Schinner F. Solubilization of inorganic caleium phosphates-solubilization mechanisms[J]. Soil Biology and Biochemistry，1995，27（3）：257-263.

[18]范丙全. 北方石灰性土壤中青霉菌P8（Penicillium oxalicum）活化难溶磷的作用和机理研究[D]. 北京：中国农业科学院，2001.

[19]赵小蓉，林启美，李保国. 微生物溶解磷矿粉能力与pH值及分泌有机酸的关系[J]. 微生物学杂志，2003，23（3）：5-7.

[20]Narsian V，Patel H H. Aspergillus aculeatus as a rock phosphate solubilizer[J]. Soil Biology and Biochemistry，2000，32（4）：559-565.

[21]Agnihotri V P. Solubilization of insoluble phosphates by soil fungi isolated from nursery seedbeds[J]. Canadian Journal of Microbiology，1970，16（9）：877-880.

[22]樊 磊，叶小梅，何加骏，等. 解磷微生物对土壤磷素作用的研究进展[J]. 江苏农业科学，2008（5）：261-263.

[23]Patgiri I，Bezbarah B. Strain contributing to phosophorus mobilization in acid soils[J]. India Journal of Agricultural Sciences，1990，60（3）：197-200.

[24]Deubel A，Gransee A，Merbach W .Transformation of organic rhizodeposits by rizoplane bacteria and its influence on the availability of tertiary calcium phosphate[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2000，163：387-392.邱 阳，苗作云，刘学芝. 贡湖壬子港藻体堆积下黑水团发生风险研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：435-439.endprint