珍稀濒危药用植物大花杓兰的研究现状

付亚娟　乔洁　侯晓强

摘要：大花杓兰是珍稀濒危药用植物，大花杓兰资源的保护和再生引起了国内外学者的广泛关注。为及时把握大花杓兰的研究现状和最新研究成果，以1997—2014年国内外关于大花杓兰的研究论文为基础，对其基础生物学、繁殖生物学、授粉生物学、植物菌根共生机制、濒危机制、保护策略等方面的研究成果进行总结与分析。

关键词：大花杓兰；人工繁殖；研究现状

中图分类号： S567.23+9.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0328-04

大花杓兰（Cypripedium macranthos）是兰科杓兰属的多年生草本植物。近年来，由于人为过度采挖及其生存环境的破坏，致使大花杓兰野生种群的数量急剧减少，总体处于濒危状态[1]。大花杓兰极具观赏价值和药用价值，其研究引起了国内外学者的普遍关注。大花杓兰种子细小，缺乏为其萌发提供营养的器官-胚乳，在自然条件下很难萌发。只有在适宜的温度、湿度等条件下，遇到特异的真菌并与之建立共生关系才能促进种子萌发[2]。目前，大花杓兰种子的非共生萌发、与真菌共生萌发、快速繁殖技术已取得一定进展，但仍处于少量微繁殖（micropropagation）阶段，其原因在于原球茎诱导率低、褐化死亡率高、幼苗生长缓慢、幼苗移栽成活率低。以1997—2014年国内外发表的研究论文为基础，对大花杓兰的研究现状进行分析和评述，有助于及时了解和掌握我国大花杓兰的研究水平、优势、不足，对丰富与拓展大花杓兰的研究领域具有重要意义。

1 文献来源及方法

通过中文期刊数据库（CNKI），以“大花杓兰”为检索词进行全文检索，获得1997—2014年关于大花杓兰的中文文献；通过NCBI PubMed、Science Direct、Springerlinker外文期刊数据库，以“Cypripedium macranthos”为检索词检索1997—2014年关于大花杓兰的外文文献，并去掉3个数据库中重复的论文。采用Excel软件进行文献相关的数据分析。

2 大花杓兰的研究概况及主要研究方向

自1997—2014年18年期间，国内外学者共发表大花杓兰研究论文31篇，其中中文期刊论文17篇、SCI收录论文14篇。研究论文发表数量较少，表明大花杓兰的研究刚刚起步，基础较为薄弱。在SCI论文中，日本学者发表多达11篇，中国学者发表2篇，韩国学者仅发表1篇，表明大花杓兰的研究主要以日本、我国为主，这与大花杓兰自然分布于俄罗斯、朝鲜半岛、我国、日本[3]密切相关。自2009年后，我国学者在国内外刊物发表大花杓兰研究论文的数量不断增加，目前为止共发表论文19篇，其中SCI收录2篇，表明我国大花杓兰的研究起步更晚，近10年才引起普遍关注并处于平稳发展时期。华北和东北是我国大花杓兰的主要分布区[4]，因此我国的研究以北京百花山、吉林长白山的大花杓兰为主。对31篇论文的研究内容进一步分析表明，关于大花杓兰体外人工繁殖的研究最多，约占论文总数的39%；其次是关于大花杓兰叶片、表皮、胚、珠被、种子、花粉的形态研究，约占论文总数的19%；随着分子生物学的发展和大花杓兰研究的不断深入，关于大花杓兰的遗传多样性、内生真菌多样性、植物-菌根真菌共生机制等方面的研究也日益广泛。

3 大花杓兰的研究进展

大花杓兰具有重要的观赏价值、药用价值、科学研究价值，并具有广泛的应用潜力。本研究对大花杓兰的生物学、繁殖生物学、传粉生物学、菌根共生机理、濒危机制、保护策略等方面进行论述，以展示近年来大花杓兰的主要研究成果。

3.1 基础生物学研究

我国学者对野生花卉、兰科植物资源、濒危保护植物资源、观赏植物资源等进行野外调查时均有提及大花杓兰，主要涉及其分布、生境、花色、数量、花期、果期等[5-11]。大花杓兰是我国北方温带地生兰的典型代表物种，主要分布于高山草甸、林下、林间草甸、林缘，因过度采集和生态环境的破坏，野生资源几近枯竭，成零星状态分布。大花杓兰极具观赏价值，花期为6—7月，通常为粉紫色或紫红色。经野外调查发现，吉林长白山区天桥岭的大花杓兰花色多样性较高，具有纯黄色、纯白色、从红色渐变为白色的多种花色。Sugiura等对日本Ruben岛的大花杓兰进行野外调查时发现，Ruben岛大花杓兰基本为黄白色或白色，紫红色大花杓兰非常罕见[12]。

陈丽飞等对长白山地区大花杓兰的叶片表皮细胞、成熟种子、花粉的微形态进行研究时发现，其叶片表皮细胞形状不规则，细胞垂周壁呈深波状，圆形或近圆形气孔随机分布于下表皮，叶片表皮有4节柔毛[13]；其种子呈长卵形，种皮表面有浅褐色网状条纹，网纹多为矩形，网壁边缘粗糙或光滑[14]；其花粉呈长球形，表面有圆形凹陷，凹陷内部有1个球形内容物，未见明显萌发孔，花粉外壁有光滑的外壁纹饰[15]。张毓等研究发现，授粉6周后的大花杓兰种胚发育至球形胚，之后没有进一步分化，直至种子成熟仍保留球形胚形态，且成熟种子具有内外双层种皮[16]。由此可见，致密干膜质内种皮可能是大花杓兰对自然环境的一种保护性适应，也可能是造成其成熟种子萌发困难的主要原因。

3.2 繁殖生物学研究

大花杓兰具有克隆生长习性，可通过分株进行无性繁殖，但1株大花杓兰成株每年只能长出为数不多的潜伏芽，繁殖系数较低。此外，长期分株繁殖可能导致品种退化，抗病虫害能力下降。人工繁殖、栽培、引种驯化等技术可以克服分株无性繁殖的不足，并能在短时间内获得大量再生植株。

3.2.1 共生萌发及繁殖 国内外学者对大花杓兰种子-真菌共萌发技术展开研究并取得了一定进展。目前已证实，对大花杓兰种子共生萌发有促进作用的菌根真菌均属于瘤菌根菌属（Epulorhiza）。从C. macranthos var. rebunense成株分离得到的菌根真菌WO97、WO034、WC035促萌发率最高，分别为21.1%、20.9%、24.1%；从幼苗、原球茎分离得到的菌根真菌促萌发率较低，为0.6%～6.6%；从C. macranthos var. speciosum分离得到的菌根真菌也能促进C. macranthos var. rebunense种子萌发，但萌发率较低，仅为1.1%～4.2%；其他兰科植物的共生真菌Rhizoctonia repens对C. macranthos var. rebunense种子萌发没有任何促进作用[17]。在不同生长发育阶段，宿主植物与其共生真菌对种子的促萌发能力存在明显差异，并具有种属特异性。张毓等从吉林长白山野生大花杓兰的根中分离得到1株瘤菌根菌属的真菌Cm-J-R-2，并证实该菌株能很好地促进大花杓兰种子萌发，平均萌发率为29.34%[18]。大花杓兰与共生真菌之间有很高的专一性，且已证实对大花杓兰种子有促萌发作用的菌根菌均为瘤菌根菌属真菌，共生真菌对种子的促萌发率基本稳定在 20%～30%。endprint

3.2.2 非共生无菌萌发及繁殖 非共生无菌萌发是目前兰花种子人工繁育中最为常用的方式。Miyoshi等研究发现，将NaClO或Ca（ClO）2处理、4 ℃冷处理打破种子休眠、细胞分裂素Kinetin（1 μM）三者有效结合可使大花杓兰成熟种子的萌发率达到60%～70%[19]。Shimura等成功建立了C. macranthos var. rebunense的微繁殖技术：成熟种子经1%NaClO消毒30～60 min后播种于含有1 μmol/L NAA和BA的培养基中；4 ℃冷处理3个月以解除种子休眠；转至20 ℃继续培养，直至种子萌发形成类原球茎的愈伤组织；每个直径为5 mm的类原球茎每年可再生约10株幼苗；幼苗经低温驯化（10 ℃ 1个月，4 ℃ 2个月）后移栽到花盆中（栽培基质为粗火山灰和黏土），约80%幼苗能较好地发育并长出新叶子[20]。Taniguchi等研究发现，C. macranthos var. rebunense未成熟种子萌发的最适培养基为T培养基或MS培养基[21]。适宜的人工培养条件（温度、湿度、培养成分、光照），加上种子和幼苗数次4 ℃冷处理，使人工繁殖的C. macranthos var.rebunense第1朵花在温室里盛开，从种子萌发到开花历时7年。王艳丽等以移栽2年的野生大花杓兰未开裂的黄绿色蒴果种子进行组织培养与快速繁殖，种子在Harvais、VWD培养基上萌发形成白色原球茎，原球茎分化诱导出芽、根后，选择高度 1.5 cm 以上、根系发达、长势良好的幼苗移入移栽基质（珍珠岩、蛭石、草炭灰、树叶的比例为1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）中，精心呵护1个月后幼苗成活率达70%以上[22]，但种子萌发率、原球茎诱导分化率、幼苗生长率、是否开花结实均未提及。张毓等研究发现，大花杓兰未成熟绿荚种子（种胚发育形成球形胚，但内种皮未形成干膜前）在VW改良培养基（2.0 mg/L 6-BA）上培养，萌发率高达60.54%[23]。邓莲等研究发现，大花杓兰（北京百花山）授粉后6～8周，种子萌发率明显高于幼嫩或成熟种子；在VWD改良培养基上培养，种子萌发率高达68%；1.2 mg/L KT是既能促进大花杓兰种子萌发，又能维持原球茎低褐化率的适宜激素浓度；有机添加物（如100 mL/L椰乳或马铃薯）有利于大花杓兰种子的萌发[24]。朴仁哲等对吉林长白山移栽2年的野生大花杓兰进行人工辅助授粉，并以授粉13周后的半成熟种子为试验材料，从种子处理、培养基、生长激素等方面探讨大花杓兰无菌萌发。研究结果表明，经0.5%NaClO处理160 min的种子萌发率最高，可达68%以上；最适培养基为Harvais培养基，最适pH值为5.5～5.8；6-BA对种子的促进萌发效果明显优于KT；添加马铃薯、苹果均可促进大花杓兰种子的无菌萌发，但马铃薯的促萌发效果更为明显[25]。

NaClO浓度、作用时间、低温预处理、培养基、培养温度、激素、有机添加物对大花杓兰种子的无菌萌发均有一定影响，但低温预处理、有机添加物并非无菌萌发所必需的。成熟种子和未成熟种子均可在实验室条件下进行无菌萌发，且萌发率高达60%左右，明显高于萌发率仅为20%～30%的共生萌发。种子的无菌萌发也有一定局限性，未成熟的种子不耐储存，采摘后须立即试验，1年只有1次试验机会，且未成熟种子的最佳采摘时期不易把握。

3.3 传粉生物学研究

Sugiura等对日本Ruben岛分布的大花杓兰进行野外资源调查时发现，熊蜂的蜂王是大花杓兰唯一的传粉者，同时也是马先蒿（Pedicularis schistostegia）的传粉者；大花杓兰与马先蒿花色相同，且花期重叠，在野外生境混生，但大花杓兰出现的频率相对较低；觅食的熊蜂有时会混淆大花杓兰和马先蒿；大花杓兰和马先蒿在空间分布上有很大程度的重叠，临近2个植物的植株高度基本一致；大花杓兰和马先蒿的淡黄色、白色花朵恰在大黄蜂的可见光谱范围内[12，26]。上述研究发现表明，C. macranthos var. rebunense通过拟态伴生植物马先蒿来引诱熊蜂传粉，其传粉机制完全不同于杓兰[27]（Cypripedium calceolus）等杓兰属的其他种类，这可能是适应环境变化的一种进化机制。

3.4 菌根共生机理

菌根真菌与兰科植物的关系十分密切，兰科植物的种子萌发、幼苗生长、植株形成都离不开菌根真菌。在自然条件下，大花杓兰种子不易萌发，需依赖真菌的侵染并与其建立共生关系，才能促进种子的萌发。目前，大花杓兰与菌根菌的共生机制尚不明确，似乎与其他陆生植物和菌根菌之间的互惠共生关系不同，而是生与死（life-and-death）的斗争关系[28]。Shimura等从大花杓兰幼苗中分离鉴定了2种抗菌活性物质lusianthrin和chrysin，并证实lusianthrin在大花杓兰种子与真菌共生萌发过程中起着重要作用，而chrysin作为植物抗毒素保护大花杓兰免受病原菌侵害[28]。开花成株的大花杓兰菌根真菌分离率明显高于其幼苗和原球茎，且成株分离到的菌根真菌更能有效促进种子萌发[17]。张亚平对吉林地区大花杓兰不同生长发育阶段的内生真菌分布进行调查，发现开花植株在萌芽期、展叶期的内生真菌分离率分别为34.52%、55.95%，而开花期内生真菌分离率仅为4.00%左右[29]。可能是生境上的差异造成了大花杓兰不同的共生营养模式，从而造成二者结果的差异。张亚平首次报道，分离鉴定的3株鸡油菌目（Cantharellales）内生真菌均能极显著提高原球茎的花芽分化率，并能降低褐化死亡率，促进大花杓兰原球茎的生长和发育。在整个生命周期中，大花杓兰可能与不同真菌建立共生关系并产生多种抗菌活性物质，有些抗菌活性物质将参与大花杓兰种子与真菌的共生萌发。上述研究结果为大花杓兰菌根共生的分子机理研究奠定了基础。

3.5 濒危机制及保育策略endprint

大花杓兰的野生种群逐渐衰退，数量急剧减少，处于濒危状态。大花杓兰濒危的主要原因并非其对现有自然环境的不适应，而是人类活动导致的生态环境破坏以及非法滥采乱挖所致[30]。林大影通过对北京濒危植物的分布及其生存群落特征的研究，计算出大花杓兰的生态位宽度为0.024，表明适于其生存的生境较少，急需优先保护[31]。为更好地保护、研究、开发利用大花杓兰植物资源，国内外学者对其开展了人工繁殖、引种驯化及相关的基础性研究，并提出一些保育策略：加强植物生境的保护；制定和完善相关法律法规，加强宣传教育，提高社会公众保护生物多样性的自觉意识；建立植物资源数据库，开展就地保护和监测；注重科研院所与高校合作研究，加强科研攻关，进行大花杓兰植物传粉、种子扩散等机理研究，从而提供合理的保护措施；迁地保护或离体保护；人工辅助进行种子原位就地播种[8，10，32-34]。

3.6 其他方面

随着分子生物学技术的发展，大花杓兰的研究领域得以不断拓展。Izawa等应用等位酶标记技术对日本Ruben岛分布的大花杓兰野生种群进行遗传多样性研究，发现C. macranthos var.rebunense比其他植物类群具有更高的遗传多样性[34]。蒋明等克隆并分析了10种杓兰属植物的ITS序列，序列长度为522～572 bp，变异位点十分丰富，其中高山杓兰和大花杓兰的ITS片段缺失现象尤为明显[35]。2014年，大花杓兰叶绿体基因组（登录号：KF92543）的测序工作已完成，丰富了兰科植物叶绿体基因组的多样性[36]。这些研究结果为兰科植物遗传多样性、分子系统发育的研究奠定了理论基础，对制定合理的大花杓兰保护策略具有指导意义。另外，秦瑀研究证实了大花杓兰的水提醇液具有利尿作用[37]，但其药用化学成分的分离纯化与结构鉴定有待进一步深入研究。

4 展望

目前，国内外学者对大花杓兰人工繁殖及其应用的研究已取得一定进展，但由于其褐化率死亡率高、幼苗生长缓慢等研究瓶颈尚未突破，致使大花杓兰人工繁殖至今仍处于少量微繁殖阶段。大花杓兰是珍稀濒危国家重点保护野生植物，其研究材料的相对匮乏导致国内外对大花杓兰内生菌多样性、菌根真菌的生理生化特性，尤其是大花杓兰-菌根真菌共生分子机理的认识十分有限，一定程度上限制了大花杓兰菌根化应用技术的发展。近年来，随着分子生物学技术的发展，ITS和DNA条形码技术等已被应用于大花杓兰遗传多样性的研究中[38]，为今后大花杓兰的原地或迁地保育提供理论基础。

从国内外发表的大花杓兰期刊论文来看，大花杓兰的研究起步较晚且发展缓慢，很多领域有待进一步深入研究。鉴于我国大花杓兰的研究现状、应用价值、开发利用前景，对我国未来大花杓兰的研究提出如下建议：全面开展大花杓兰植物资源的现状调查，系统了解其分布、生境、数量、生长及繁殖状况，深入开展生态学、居群生物学等基础性研究，为制定合理、有针对性的保育策略提供理论基础。应用mRNA差异显示技术、RT-PCR、RACE方法等强有力的技术手段，筛选参与共生萌发的关键候选基因，为深入研究大花杓兰植物菌根共生的分子机理提供科学线索。建立优良菌株的筛选、培养、评价体系，筛选能有效促进大花杓兰植物种子萌发、原球茎分化、幼苗生长发育的菌根真菌，为应用菌根共生技术实现大花杓兰植物资源的保护和规模化繁殖奠定基础。结合DNA条形码技术、野外生态学开展人工繁殖大花杓兰“回归自然”的相关研究，这是缓解大花杓兰濒危程度、恢复其野生种群最为直接有效的技术手段，也是深入开展其他研究工作的重要基础。

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