铁皮石斛组培体药用和营养成分含量的比较

张本厚　胡燕花　金磊磊　陈集双

摘要：为了探明铁皮石斛组培体中药用和营养成分含量，比较研究3种铁皮石斛组培体和人工栽培铁皮石斛干物率、多糖含量、总生物碱含量和总蛋白质含量。结果表明：三年生人工栽培铁皮石斛茎段干物率为20.79%，显著高于3种铁皮石斛组培体，原球茎干物率为3.77%，显著低于2种组培苗；三年生人工栽培铁皮石斛茎段多糖和总生物碱含量分别为24.66%和0.027%，均显著高于3种铁皮石斛组培体，原球茎多糖和总生物碱含量分别为11.53%和0018%，均显著高于2种组培苗；3种铁皮石斛组培体总蛋白含量均显著高于三年生人工栽培铁皮石斛茎段（687%），原球茎总蛋白含量为22.19%，显著高于2种组培苗。综合而言，虽然铁皮石斛原球茎水分含量较高，但其增殖速率远大于人工栽培铁皮石斛和组培苗；在药用和营养成分方面，虽然铁皮石斛原球茎的多糖和总生物碱含量低于人工栽培铁皮石斛，但其多糖、总生物碱和总蛋白含量均高于2种组培苗。因此，铁皮石斛原球茎具有很好的开发应用前景。

关键词：铁皮石斛；组培体；药用成分；营养成分；多糖；总生物碱；总蛋白

中图分类号： S567.23+9.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0324-04

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，始载于《神农本草经》，为我国传统的名贵中药材，被誉为“中华九大仙草之首”。《中国药典》（2010年版）记载，铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热等功效。现代药理研究表明，铁皮石斛具有增强免疫力[1-3]、降血压[4]、降血糖[5]、抗肿瘤[6-8]、抗氧化[9-11]等作用。由于铁皮石斛种子极小、无胚乳、自然条件下须与真菌共生才能萌发，萌发率低，自然情况下多采用无性繁殖方式进行增殖，增殖率较低，加之铁皮石斛野生资源过度采挖以及所依赖环境的破坏，野生铁皮石斛资源已经濒临灭绝[12]，成为“濒危珍稀植物”，被列入《国家重点保护野生药材物种名录》和《中国植物红皮书》[13-14]，已无法满足市场需求。为保护和持续利用这一珍稀中药品种，植物组织培养和人工栽培技术已广泛用于铁皮石斛生产。目前，铁皮石斛药源以人工栽培的铁皮石斛为主，但供需缺口仍相当悬殊，主要是由于铁皮石斛人工栽培存在成活率低、生产周期长、成本高、植株生长不一等问题。近年来，不少研究表明，铁皮石斛组培体与原药材药效相似[15-16]，其是否可以成为铁皮石斛替代性药源，从中提取有效成分，引起人们的广泛关注。本研究以3种铁皮石斛组培体与人工栽培铁皮石斛为材料，比较其干物率、2种药用成分（多糖和总生物碱含量）和1种营养成分（总蛋白含量），为铁皮石斛组培体的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为4种铁皮石斛人工培养体：固体培养30 d的铁皮石斛原球茎、固体继代培养60 d的3 cm铁皮石斛组培小苗、固体继代培养120 d的7 cm铁皮石斛组培大苗、三年生人工栽培铁皮石斛茎段。本试验所有供试材料均来自同一株铁皮石斛，其中原球茎和组培苗是将该植株成熟种子通过植物组织培养获得的，三年生人工栽培铁皮石斛茎段是将该植株置于自然环境中人工栽培3年获得的。

1.2 试验方法

1.2.1 干物率的测定 称取100 g左右的铁皮石斛新鲜样品（m1），104 ℃ 20 min杀青，80 ℃烘干至恒质量，准确称取铁皮石斛样品干质量（m2）。

干物率=m2/m1×100%。

1.2.2 多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的制作 准确称取10.00 mg经80 ℃烘干至恒质量的蔗糖标准品，置于100 mL的容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，充分混匀。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于试管中，加蒸馏水至2 mL，同时以2 mL蒸馏水为空白对照。依次加入0.5 mL蒽酮溶液（1.00 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯）和5 mL浓硫酸，充分混匀，置于沸水浴中加热10 min，取出冷却至室温，于620 nm处测得吸光度。

1.2.2.2 样品多糖含量的测定 将铁皮石斛新鲜样品于104 ℃下杀青20 min，80 ℃烘干至恒质量，研成粉末，精确称取0.10 g铁皮石斛样品粉末置于三角瓶中，加入20 mL 80%乙醇，超声提取2次，3 500 r/min离心5 min后弃上清（以去除单糖、低聚糖及苷类等干扰性成分），将残渣用蒸馏水清洗2次，加入6 mL蒸馏水，沸水浴提取30 min，提取液经2层滤纸过滤，收集滤液，残渣重复提取2次，合并2次滤液并加蒸馏水至200 mL。取1 mL置于试管中，加蒸馏水至3 mL，充分混匀，作为样品液（稀释3倍）。取2 mL样品液，同时以2 mL蒸馏水作为空白对照，按照标准曲线的操作方法于620 nm处测吸光度。

1.2.3 总生物碱含量的测定 总生物碱含量的测定方法参照金蓉鸾等的方法[17-18]。（1）标准曲线的制作。精确称取1.00 mg 石斛碱标准品置于100 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度线。分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于分液漏斗中，加三氯甲烷至10 mL，同时以10 mL三氯甲烷为空白对照，加入pH值为4.5的缓冲液5 mL和0.04%溴甲酚绿溶液2 mL，剧烈振摇3 min，静置30 min。三氯甲烷层通过经三氯甲烷浸泡处理并干燥后的药棉滤过，取5 mL三氯甲烷续滤液，加001 mol/L NaOH-无水乙醇溶液l mL，充分混匀，于620 nm处测吸光度。（2）样品总生物碱含量的测定。将铁皮石斛新鲜样品烘干，精确称取0.50 g样品粉末（过60目筛）置于 25 mL 三角瓶中，加入3～5 mL浓氨水充分润湿后，密闭放置30 min，加入10 mL三氯甲烷，称质量，置于水浴锅中加热回流提取2 h，冷却后称质量，补充三氯甲烷至原质量，过滤。取2 mL置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，充分混匀，作为样品液（稀释5倍）。endprint

取10 mL样品液，同时取10 mL三氯甲烷作为空白对照，按照标准曲线的操作方法，于620 nm处测得吸光度。同时取石斛碱标准溶液（25 μg/mL）2 mL置于25 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，充分混匀，取10 mL（含20 μg石斛碱）置于分液漏斗中，按照标准曲线的操作方法，于620 nm处测得吸光度，则

总生物碱含量=D样品液×20 μg×n÷D标准品溶液÷m。

式中：D样品液代表样品液吸光度；D标准溶液代表石斛碱标准溶液吸光度；n代表稀释倍数；m代表样品质量。

1.2.4 总蛋白含量的测定 将铁皮石斛新鲜样品烘干，精确称取0.10 g置于研钵中，加入0.02 g石英砂和2 mL 30% NaOH溶液，研磨2 min后再加入10 mL 60%碱性乙醇，研磨5 min；然后用60%碱性乙醇将研磨好的样品无损地洗入50 mL 容量瓶中，60%碱性乙醇定容至刻度，摇匀后静置片刻，取部分浸提液3 500 r/min离心10 min。吸取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用60%碱性乙醇定容至刻度，作为样品液。利用分光光度法，于280、260 nm波长下分别测定吸收度，则

总蛋白含量=（1.45×D280 nm-0.74×D260 nm）÷V÷1 000÷m×100%。

式中：D280 nm代表蛋白质提取液在280 nm处测得的吸光度；D260 nm代表蛋白质提取液在260 nm处测得的吸光度；V代表将所有样品提取液稀释成测量液浓度后的总体积，mL；m代表样品质量，g。

1.2.5 数据处理 运用SPSS 17.0中的单因素方差分析（One-way ANOVA）比较4种不同铁皮石斛培养体之间的干物率、多糖含量、总蛋白质含量和总生物碱含量的差异性。

2 结果与分析

2.1 干物率的比较

4种铁皮石斛培养体鲜品和干品形态对比结果如图1所示。4种铁皮石斛培养体干物率比较结果如表1所示，随着培养时间的增加，干物率呈递增趋势，三年生人工栽培铁皮石斛茎段干物率最高，为20.79%，显著高于其他3种铁皮石斛组培体。3种铁皮石斛组培体中，原球茎干物率为3.77%，显著低于2种组培苗。3 cm组培小苗和7 cm组培大苗干物率分别为6.21%和7.82%，且7 cm组培大苗干物率显著高于3 cm 组培小苗。

2.2 多糖含量的比较

以蔗糖浓度（C1，μg/mL）为横坐标，吸光度（D1）为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为D1=0.011 4C1-0.000 5，r2=0.999 3。

4种铁皮石斛培养体多糖含量比较结果如图2所示，三年生人工栽培铁皮石斛茎段多糖含量最高，为24.66%，显著高于其他3种铁皮石斛组培体。3种铁皮石斛组培体中，原球茎多糖含量为11.53%，显著高于2种组培苗。3 cm组培小苗和7 cm组培大苗多糖含量分别为5.76%和6.71%，两者之间没有显著差异。

2.3 总生物碱含量的比较

以石斛碱浓度（C2，μg/mL）为横坐标，吸光度（D2）为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：D2=0.075 5C2+0.000 7，r2=0.999 0。

4种铁皮石斛培养体总生物碱含量比较结果如图3所示，三年生人工栽培铁皮石斛茎段总生物碱含量最高，为0.027%，显著高于其他3种铁皮石斛组培体。3种铁皮石斛组培体中，原球茎总生物碱含量为0.018%，显著高于2种组培苗。3 cm组培小苗和7 cm组培大苗总生物碱含量分别为0.013%和0.012%，两者之间没有显著差异。

2.4 总蛋白含量的比较

4种铁皮石斛培养体总蛋白含量比较结果如图4所示，随着培养时间的延长，总蛋白含量呈递减趋势，三年生人工栽培铁皮石斛茎段总蛋白含量为6.87%，显著低于其他3种铁皮石斛组培体。3种铁皮石斛组培体中，原球茎总蛋白含量为22.19%，显著高于2种组培苗。3 cm组培小苗和 7 cm 组培大苗总蛋白含量分别为18.82%和16.14%，且3 cm组培小苗总蛋白含量显著高于7cm组培大苗。

3 结论与讨论

铁皮石斛组织培养物是否可以作为铁皮石斛替代性药源，并从中提取有效成分，主要取决于其有效成分的含量和药理作用。目前，已有众多研究表明铁皮石斛组培体与原药材具有相似的药理作用[6，15-16，19-24]。多糖为铁皮石斛最主要的有效成分，因此铁皮石斛组培体中多糖含量成为评定组培体质量的重要因素。许多研究结果显示，铁皮石斛组培体多糖含量低于铁皮石斛枫斗、人工栽培或野生铁皮石斛[19，25-28]，这与本试验结果一致，但也有研究报道铁皮石斛组培体多糖含量与人工栽培或野生铁皮石斛相当甚至更高[16，29-30]。本试验结果显示，3种铁皮石斛组培体中原球茎多糖含量显著高于2种组培苗，与大多数前人的研究结论[19，27，29，31]一致，也有少数研究结果显示铁皮石斛组培苗多糖含量高于原球茎或拟原球茎[25，32]。

生物碱是铁皮石斛重要的有效成分之一，铁皮石斛组培体中生物碱含量也会影响组培体的品质。辛甜等的研究结果显示，铁皮石斛组培体的生物碱含量低于铁皮石斛枫斗、栽培植株和野生植株[19，33]，这与本试验结果一致；但是孙丹的研究结果显示，铁皮石斛原球茎生物碱含量高于一年生栽培植株[29]。本试验结果显示，3种铁皮石斛组培体中原球茎总生物碱含量显著高于2种组培苗，与大多数前人的研究结论[19，29]一致，但是李莹的研究结果显示铁皮石斛原球茎的生物碱含量略低于组培苗[32]。

铁皮石斛作为一种药食同源的中药材，除了药用价值外，其营养价值也不容忽视。蛋白质是一种重要的营养成分，可以满足人们对蛋白质和氨基酸的需求。目前铁皮石斛组培体虽不可直接入药或食用，但在有效成分提取过程中，蛋白质可以作为营养保健品加以提取利用，因此铁皮石斛组培体的蛋白质含量和氨基酸组成对其蛋白质的利用具有重要的意义。目前，已有不少学者对铁皮石斛组培体与铁皮石斛枫斗、栽培植株或野生植株的蛋白质或总氨基酸含量进行研究，结果显示随着培养时间的延长，蛋白质或总氨基酸的含量呈递减趋势[25，28，30，34]，这与本试验结果一致，这可能与随着培养时间的延长，铁皮石斛组培体或栽培植株的纤维化程度逐渐加深、生长活跃程度逐渐降低有关。关于铁皮石斛蛋白质氨基酸的组成本试验未着重分析研究，有待后续试验进一步研究。目前已有不少研究对铁皮石斛组培体蛋白质的氨基酸组成进行分析，大部分研究结果显示组培体蛋白质的氨基酸组成与铁皮石斛枫斗的栽培植株或野生植株一致[19，28，34]。endprint

本研究结果表明，随着培养时间的延长，铁皮石斛组培体或栽培植株的干物率逐渐增加，其水分含量逐渐降低，这可能与其纤维化程度逐渐加深有关。

综上所述，3种铁皮石斛组培体中，原球茎的多糖、总生物碱和总蛋白含量均最高，虽然其多糖和总生物碱含量低于三年生人工栽培铁皮石斛茎段，水分含量较高，但是其增殖速率快、生长周期短、产量高；生产条件可控、产品质量均一，便于标准化生产；生产方式简便、生产成本低等优势，将铁皮石斛原球茎作为铁皮石斛替代性药源，从中提取药用和营养成分，用于医药、保健品、护肤品等行业，具有很好的开发应用前景，同时也缓解了铁皮石斛野生资源枯竭、药源紧缺等问题，对于保护铁皮石斛野生资源、实现其可持续利用具有重要意义。

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