非洲紫罗兰原生质体制备条件优化

郭爱华

摘要：以苗龄为15 d的非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl）幼苗顶端2片完全伸展的叶片为材料，从酶浓度、酶配比、时间、温度、渗透压等方面设置试验，研究制备非洲紫罗兰原生质体的条件，最终得出1组制备其原生质体的良好条件，即酶组合为1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶，酶解时间为3 h，酶液渗透压即甘露醇浓度为0.6 mol/L，温度为25 ℃，在此条件下可分离出大量有活力的原生质体。

关键词：非洲紫罗兰；原生质体；制备；优化

中图分类号： S681.203 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0230-03

非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl），原产于东非热带地区，多年生草本植物，苦苣苔科非洲堇属，别名非洲堇。其植株是适合室内盆栽的优良花卉，花色斑斓、玲珑小巧、四季开花。20世纪80年代中国才从欧美地区引种试管苗。目前，仅少数园艺公司拥有小批量生产技术，国内非洲紫罗兰在品种创新、生产规模化、基因多样性及稳定性等研究方面都受到较大制约。随着经济飞速发展，人民生活水平和品味的提高，人们对居家环境的要求也显著增高，非洲紫罗兰作为兼具优良观赏功能与环境净化功能的花卉品种，备受消费者欢迎，市场前景广阔[1]。

原生质体是除去细胞壁的植物细胞，其细胞膜较薄，适用于生物工程，是创造新品种和进行基因遗传改良的理想材料，是在细胞水平上进行植物人工育种和栽培体系的有效方法，是提高产业化、规模化水平的有效途径[1-3]。探讨非洲紫罗兰原生质体的制备，为进一步研究其基因表达及培育新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

非洲紫罗兰（混色）种子购于北京鑫农丰农业技术研究所。

1.2 幼苗培养及试验方法

1.2.1 幼苗培养 将种子用0.1%氯化汞表面消毒后置于培养皿中水培15 d，剪取无菌苗顶端2片完全伸展的叶片，蒸馏水冲洗干净，用双面刀片将其切成1～2 mm的小碎块。

1.2.2 标准液的配制 非洲紫罗兰幼苗培养标准液配制见表1。

1.2.3 原生质体的制备 纤维素酶（cellulase R-10）浓度有1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，果胶酶（pectinase Y-23）浓度有0%、0.5%、1.5%、2.0%，分别制成16种不同浓度的混合酶溶解于配有0.4 mol/L甘露醇的标准液中，将pH值调至5.6。酶解非洲紫罗兰幼苗以确定纤维素酶和果胶酶对原生质体制备的影响。每次取0.5 g 1～2 mm叶片小碎块，置于试管，加入5 mL的酶解液，25 ℃生化培养箱解离2 h，60 r/min 摇床黑暗条件下解离2 h。酶解后经280目尼龙网筛过滤除去细胞团滤液与未酶解完全的组织。

1.2.4 原生质体产量及活力测定 原生质体的产量计算参考张晓可等方法[4]；原生质活力的测定采用参考文献[1]的方法。以原生质体产量及原生质体活力确定最佳酶配比。

1.2.5 酶解时间与原生质体分离 设1、2、3、4、5 h共5个时间处理，即将叶片转入加有最佳酶组合的酶解液中解离上述时间后再置于60 r/min摇床上黑暗条件下解离2 h，比较酶解时间对制备非洲紫罗兰原生质体的影响。

1.2.6 甘露醇与原生质体分离 将叶片加入到前面选取的最佳酶解液中，分别加入甘露醇0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L共4个处理，用所选取的最佳时间进行解离，比较不同渗透压对原生质体制备的影响。

1.2.7 酶解温度与原生质体分离 依据试验获得的最佳酶解条件，设置4个温度处理，分别为23、25、27、30 ℃。根据原生质体数量及活力比较4个温度条件下对非洲紫罗兰原生质体制备的影响。

2 结果与分析

2.1 酶组合及配比对原生质体制备的影响

影响原生质体分离的因素较多，但酶类组合及浓度大小是影响原生质体分离的主要因素之一，不同的酶组合对原生质体产量和活力影响不同[5]。本试验采用不同浓度的纤维素酶R-10和果胶酶Y-23进行组合研究，根据非洲紫罗兰原生质体产量和活力得出最佳酶配比，从表2可以看出，酶解液中只加纤维素酶R-10时，原生质体产量较少，且原生质体的产量随着纤维素酶R-10含量的增加明显增加，当纤维素酶R-10含量超过2%时，原生质体的产量有所下降；在酶解液中同时加入果胶酶Y-23时原生质体产量增加，但当其含量超过1%时，原生质体的产量降低。从活力来看，组合酶浓度低时非洲紫罗兰原生质体的活力较高，随着组合酶酶浓度的增加，其原生质体活力有所下降。因此，酶液组合为1.5%维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23时对制备非洲紫罗兰叶片原生质体较适合。

2.2 酶解时间对原生质体制备的影响

时间过短，原生质体产量低，时间过长则导致原生质体中毒或破裂[6-7]。本试验在确定了最佳酶解组合后，在此条件下分析了不同的酶解时间对非洲紫罗兰原生质体的制备影响，从图1可以看出，随酶解时间的推移原生质体的产量先迅速提升后再下降；从图2可以看出，原生质体活力的变化也为先升高后降低。酶解3 h时原生质体产量和活力均达到最大值，经分析与其他条件下的产量（|t3，4|=7.76，P<0.01）和活力（|t3，4|=7.85，P

2.3 渗透压对原生质体制备的影响

原生质体分离过程中，常加入一些药品如甘露醇、蔗糖、山梨醇、葡萄糖等作为渗透压稳定剂，不同植物材料所要求的酶液渗透压不尽相同[6-7]，因此，适宜浓度的渗透压稳定剂对原生质体的稳定和产出具有重要意义[7]。本试验选择甘露醇作为制备原生质体的渗透压稳定剂，在酶解液中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的甘露醇，酶解3 h，原生质体产量与活力的测定结果见表3。甘露醇浓度从0.2 mol/L上升后，非洲紫罗兰原生质体的产量和活力也随之升高；浓度为 0.6 mol/L 时，其产量和活力均达到最大值，经分析产量与其他条件相比差异极显著（|t0.6，0.8|=11.2，Pendprint

2.4 温度对原生质体制备的影响

温度对非洲紫罗兰原生质体的制备影响也较大。从图3可以看出，在所选取的温度范围内，开始时随着温度升高，原生质体产量逐渐上升，当温度为25 ℃时，原生质体的产量达到最高值，温度为25、27 ℃条件下，二者的产量差异极显著（|t25，27|=7.21，P

3 讨论

影响原生质体制备的条件因素非常多，如木本或草本材料、对材料的预处理、pH值、酶的构成及配比、酶解的温度、酶解的时间、渗透压等[9-10]，每一种条件的细微变化都会影响原生质体的制备，使获得的原生质体产量和活力不同。本研究主要从酶浓度、酶配比、时间、温度以及渗透压等方面设置试验探讨制备非洲紫罗兰原生质体的条件，最终得出一组制备其原生质体的最适条件：即1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶，酶解时间为3 h，甘露醇浓度为0.6 mol/L，温度为25 ℃，在此条件下可分离出大量有活力的原生质体。此结果为非洲紫罗兰的基因遗传研究、培育新品种及物种多样性提供了理论基础。

参考文献：

[1]陈 鑫，李 骏，余汝媛，等. 非洲紫罗兰原生质体的制备及不同组分培养基对细胞增殖的影响[J]. 广东药学院学报，2012，28（5）：497-501.

[2]王 莉，姚占军. 植物原生质体的制备与活力检测研究进展[J]. 生物技术通报，2009（增刊）：46-50.

[3]张晓可，於丙军. 大豆幼苗根和叶片原生质的分离与纯化[J]. 大豆科学，2009，28（4）：697-701.

[4]杨 茹，刘世琦，张自坤，等. 大蒜原生质体游离和纯化的研究[J]. 中国农学通报，2010，26（4）：195-199.

[5]Duquenne B，Eeckhaut T，Werbrouck S，et al. Effect of enzyme concentrations on protoplast isolation and protoplast culture of Spathiphyllum and Anthurium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91（2）：165-173.

[6]羿德磊，王海朋，崔为正，等. 桑树原生质体分离条件的优化试验[J]. 蚕业科学，2012，38（2）：204-209.

[7]李玉珠，陶 茸，王 娟，等. 百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究[J]. 草地学报，2010，18（6）：798-804.

[8]蔡 肖，康向阳. 小青杨叶肉原生质体分离条件的研究[J]. 中国农学通报，2011，27（10）：18-22.

[9]邢朝斌，沈海龙，赵星宇，等. 刺五加幼叶原生质体的分离法[J]. 植物生理学通讯，2006，42（2）：288-290.

[10]杨光梅，杜春蕾，黄晓华，等. 辣根叶片原生质体分离条件的研究[J]. 种子，2010，29（2）：48-51.endprint