甘油、乙二醇对山羊精子形态结构的影响

2015-12-23黄亚娟刘文娟邸俊龙

养殖与饲料 2015年11期

关键词：顶体活率保护剂

黄亚娟刘文娟邸俊龙

1.陕西省泾阳县泾干镇动物防疫站，陕西泾阳 713700；2.陕西省榆林市靖边县镇靖乡畜牧兽医工作站，陕西靖边 718500；2.西安市阎良区关山镇畜牧兽医站，西安 710089

甘油、乙二醇对山羊精子形态结构的影响

黄亚娟1刘文娟2邸俊龙3

1.陕西省泾阳县泾干镇动物防疫站，陕西泾阳 713700；2.陕西省榆林市靖边县镇靖乡畜牧兽医工作站，陕西靖边 718500；
2.西安市阎良区关山镇畜牧兽医站，西安 710089

根据布尔山羊冷冻精液质量监测结果，目前国内山羊冷冻精液解冻后的活力达30%以上。情期受胎率达60%左右，辽宁原种场在此基础上于2004年开始对辽宁绒山羊细管冷冻精液的稀释液、精液处理，冷冻工艺解冻方法及受胎率结果等作了比较系统的研究，取得了较好的结果。本试验通过对最佳基础液的筛远，最佳保护剂种类及含量的筛选，分别用含甘油、乙二醇的最佳冷冻稀释液对山羊的精液进行处理，根据冷冻和解冻的结果，对精子活率、畸形率，顶体完整率进行研究。

甘油；乙二醇；情期受胎率；精子活率

1 材料与方法

1.1 试验材料

体格健壮、健康无传染病且性欲旺盛的种公羊，精液要求呈现乳白色成略带黄色云雾状明显，pH在6.8±0.2范围内，目测活率在0.7以上，种公羊均身体健康，精神状态良好。

供选择的稀释液配方如下：

Ⅰ基础液：葡萄糖8 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅱ基础液：葡萄糖3 g、柠檬酸钠3 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅲ基础液：三羟甲基氨基甲烷4.34 g、葡萄糖0.70 g、蔗糖1.60 g、柠檬酸钠1.972 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅳ基础液：乳糖4.6 g、葡萄糖3.1 g、柠檬酸钠1.5 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL乙二醇；（3）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.47 mL甘油；（4）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.47 mL乙二醇。

Ⅴ基础液：乳糖5 g、葡萄糖3 g、柠檬酸钠1.5 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅵ基础液：乳糖6 g、柠檬酸钠1.5 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅶ基础液：乳糖3.8 g、葡萄糖2.6 g、柠檬酸钠1.3 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

Ⅷ基础液：葡萄糖1.15 g、柠檬糖2.6 g、柠檬酸1.0 g、二羟甲基氨基甲烷1.84 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：8.0 mL基础液+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

VⅢ基础液：葡萄糖0.96 g、柠檬酸钠1.36 g、二羟甲基氨基甲烷2.42 g、双蒸水100 mL，灭菌。（1）处理：基础液8.0 mL+2.0 mL卵黄+0.35 mL甘油；（2）处理：基础液8.0 mL+2.0 mL卵黄+0.5 mL甘油。

以上每种基础液消毒灭菌后放凉，再按每毫升各加青霉素、链霉素1 250 IU混匀即可保存。

1.2 试验设计

选用合格新鲜精液，按以上20个稀释液分别进行处理，每个处理6个重复，根据冷冻解冻后的活率选出最佳稀释液的基础液，将选出的基础液按表1浓度添加保护剂，配成稀释液，用此稀释液再进行冷冻处理，每个处理重复6次，再以解冻后精子的活率、畸形率，顶体完整率，得出分析结果（表2）。

表1 保护剂的添加量

表2 基础液的筛选结果

1.3 试验过程

1）将所需用品严格消毒后，将镜检合格的新鲜精液按1∶3体积比稀释后，装管置于0～4℃环境中平衡2 h。

2）平衡后，将细管精液置于液氮中冷冻5～10 min。

3）解冻镜检：将冷冻后的精液置于38℃水浴中解冻后，制切片，观察活率。

4）标记分装，保存，对统计数据进行分析，选出最佳基础液。

5）用最佳基础液按表1配成稀释液，重复以上操作分别选出甘油、乙二醇的最佳稀释液A、B。

6）用A、B 2个稀释液作冷冻精液处理，制作抹片，进行活率、畸形率，顶体完整率的观察。

7）对结果进行统计分析，得出结论。

2 结果

2）IV基础液中添加不同浓度甘油对精子成活率的影响结果（=6）。由活率为依据进行选择，添加4.7%的甘油的效果明显好于其他浓度，经显著性检验，添加4.7%的甘油组与总体样本比较，差异显著（＜0.05），故可以选择甘油的最佳浓度为0.47（表3）。

表3 不同浓度甘油对精子成活率的影响结果

表4 不同浓度乙二醇对精子成活率的影响结果

4）用A（含4.7%甘油）、B（含4.7%乙二醇）、C（新鲜精液）3个处理组对精子畸形率的影响（n=6）。甘油处理组的畸形率显著高于对照组和乙二醇处理组（＜0.01）；乙二醇的处理组的畸形率显著高于对照组（＜0.01）（表5）。

表5 不同处理组对精子畸形率的影响结果

表6 不同处理组对精子顶体完整率的影响结果

3 讨论

冷冻精液人工授精技术应用到生产中以来，只是在牛的生产上应用比较多。由于冷冻精液的活率、畸形率、顶体异常率等各方面因素的影响，使得受胎率于自然交配相比较低，从而使此技术在山羊生产上未得到大面积推广。因此保护剂添加的种类和浓度，是目前研究的一个热点。精子在冷冻过程中，水分子重新按几何图形排列形成冰晶，冰晶可以使精子膜内的浓度和渗透压增高，水由精子内向外渗透，造成精子细胞脱水，发生不可逆的化学毒害而死亡。同时，精子水分形成冰晶，其体积增大且形状不规则，由于冰晶的扩展和移动，造成精子膜和细胞内部结构的机械损伤，引起精子死亡，所以，在冷冻过程中要尽量避开形成冰晶最多的温度范围（-15～25℃），在冷冻过程中就要以最快的速度降温通过发生冰晶化的温度范围，形成玻璃化。快速降温时应添加一定量的甘油、乙二醇、二甲亚砜等抗冻保护物质，以增加精子的抗冻能力，防止发生冰晶化。

保护剂中，甘油具有较强的吸水性，抑制水分子形成冰晶，使水处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，缩小危险温度区。研究表明，甘油浓度过高对精子有毒害作用，可能造成其顶体和颈部损伤，尾巴弯曲及某些酶类破坏，降低其受精能力。乙二醇具有较强的亲水性能，能有效保护精子免受冰晶伤害，而且其浓度过高对于精子的毒害作用远小于甘油。

本试验研究发现，在低浓度的保护剂作用下（0.30～0.35 mL范围内/10 mL冷冻稀释液中），甘油的保护作用与乙二醇的保护作用相比，差异不显著，也就是二者并没有本质的区别，保护剂体积增加到0.35 mL以上时，乙二醇的保护作用明显强于甘油，当保护剂体积达到0.5 mL时，二者的保护作用都呈于下降趋势，在这个过程中，精子的形态结构也发生了一系列的变化，本试验设置了2个处理组和1个对照组，即用所选择的最佳基础液，分别加入最适浓度的甘油和乙二醇后，制作抹片，在油镜下统计出了各自的畸形率、顶体完整率，再以新鲜精液制成抹片作为对照组来进行生物统计学分析，结果发现，无论是甘油，还是乙二醇处理组，都与对照组差异显著，也就是说，在添加保护剂的过程中，精子的活率、畸形率、顶体完整率都不可避免地受到了很大的影响，甘油与乙二醇的处理组相比，甘油处理组的效果无论从活率、畸形率还是顶体完整率上分析，都不如乙二醇处理组好。

另外，在这个实验的整个研究过程中，还存在一些不可知因素的影响，还存在一些尚未解决的问题，如在研究过程中，基础液、稀释液的原始配方都选取的一些实际生产中常用的一些配方，这些配方添加保护剂的浓度都是从3%开始，5%结束，那么3%以下的添加浓度，按照理论知识，甘油应明显强于乙二醇5%以上的添加浓度，乙二醇应明显强于甘油，但试验研究的添加浓度具有局限性，因而出现了一些不一致的地方，有待于进一步的探讨。就整个冷冻过程中，气温、光线、冷冻时间的微小差异，都有可能导致结果出现微小的偏差。在解冻过程中，水温的高低、解冻时间的长短以及解冻技术的熟练程度，也都会对结果产生一定影响。本试验在基础液中添加的营养剂为蛋黄，根据实际生产上的经验，添加等量鲜奶的效果优于蛋黄，以上是整个试验中存在的一些问题。