培育中的淮猪新品系ECI1基因多态性及其与背膘厚的相关性研究

鲁云风，李庆岗，王志秀，张博，吴克亮，张浩*

（1.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳473061；2.中国农业大学动物科技学院，北京100193；3.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

培育中的淮猪新品系ECI1基因多态性及其与背膘厚的相关性研究

鲁云风1，2，李庆岗3，王志秀2，张博2，吴克亮2，张浩2*

（1.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳473061；2.中国农业大学动物科技学院，北京100193；3.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

为分析ECI1基因多态性与背膘厚性状的遗传关系，采用PCR-RFLP技术，检测286头淮猪新品系Ⅱ系Ⅱ世代个体ECI1基因的遗传变异，统计分析ECI1基因型与背膘厚性状的关联性。结果表明：培育中的淮猪新品系猪群中存在丰富的ECI1基因多态性，CC型个体的活体背膘厚显著高于TT型个体（P＜0.01），TC型个体处于中间。该研究进一步验证了ECI1基因对淮猪新品系育肥性状的影响效应，为ECI1基因作为淮猪新品系的分子遗传标记提供理论依据。

ECI1；背膘厚；淮猪新品系

提高肌内脂肪含量和降低背膘厚被认为是提高肉质性状和猪育种规划的重要目标［1-2］。猪的肉质性状属于低遗传力的数量性状,常规的育种方法很难取得较大的遗传进展,国内外学者研究了一些控制该性状的主效基因和QTL［3-5］用于分子辅助育种。脂肪尤其是动物体脂的沉积量是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态,脂质的沉积与代谢是受多基因控制的复杂数量性状,并且受制于脂肪合成与代谢平衡状态［6］,脂肪酸则是脂质合成和代谢的中间产物。∆3-∆2-烯酸-辅酶A异构酶(ECI1)是参与β氧化过程中双键新陈代谢所必须的辅酶［7］,在不饱和脂肪酸新陈代谢过程中起重要作用［8-9］,本课题组前期研究发现ECI1基因在中国地方脂肪型猪背脂和背最长肌中表达量均显著高于外来瘦肉型猪(数据未发表),表明其极有可能是调控猪脂肪代谢的主效基因。

培育中的淮猪新品系是以地方品种淮猪作第一母本,以长白和大约克分别为第一、第二父本进行杂交育种和横交固定而成的新品系猪,含淮猪血统25%,长白血统25%,大约克血统50%,其背膘厚处于淮猪和引进品种(长白和大约克)之间［10-11］。

本文对培育中的淮猪新品系的脂肪性状候选主效基因ECI1多态性进行检测,分析ECI1基因多态性与肉质性状背膘厚的遗传关系,为ECI1基因作为淮猪新品系的分子遗传标记世代选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料以地方品种淮猪和长白猪作第一母本、第一父本,其后代母猪为第二母本,大约克为第二父本,所产后代为淮猪新品系零世代,在零世代的基础上进行横交固定,于2008年成功培育出淮猪新品系I系［10］。淮猪新品系猪群饲养在安徽省农科院畜牧兽医研究所猪育种基地-科鑫公司猪场,采集Ⅱ系Ⅱ世代286头母猪耳组织样品,迅速放入装有75%酒精的离心管中,实验室冷冻保存,用于提取基因组DNA。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取采用苯酚-氯仿抽提法［12］,Naro Drop2000测定浓度,TE溶解,-20℃保存。

1.2.2 引物设计合成根据前期克隆得到的猪ECI1基因序列(GenBank：KC447361.1)及在淮猪、大白猪群体中测序扫描得到的具多态性位点的SNP (intro3-C54T)设计引物,正向引物序列5′-GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3′,反向引物序列5′-GGAACAGCCAGCCACTTG-3′,扩增区域为ECI1基因部分第2外显子、第3内含子及第3外显子,片段大小为349 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增PCR反应体系(20 μL)：10×Buffer 2 μL,dNTPs Mix(10 mmol/L)0.5 μL,10 μmol/L的双向引物各0.5 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL, DNA模板1 μL,加双蒸水至20 μL。反应条件：95℃预变性5 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,最后72℃延伸5 min。

1.2.4 限制性内切酶酶切(RFLP)酶切反应体系为20 μL,其中内切酶Bsm I(美国NEB公司)0.4 μL (4 U),10×Buffer 2 μL,PCR产物10 μL,加双蒸水至20 μL。反应温度为37℃,酶切6 h。酶切后的片段经2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察和记录酶切结果。

1.2.5 背膘厚测定在生长性能测定结束时称量试验猪体重,采用A超(美国运高)测定膝关节前缘引线与背中线垂直相交(腰荐部)距背中线左侧4 cm处的活体背膘厚［13-14］,按如下公式校正到90 kg活体背膘厚。

校正背膘厚=实测背膘厚×A÷{A+[B×(实测体重-90)]}。由于都是母猪,故A=13.706,B=0.119624。

1.2.6 统计分析采用SPSS 13.0软件的一般线性模型(GLM)过程,对ECI1基因多态性与淮猪新品系母猪群体背膘厚的相关性进行最小二乘分析,模型为yi=u+ai+ei。其中,yi为个体性状观测值；u为群体均值；ai为基因型效应值；ei为随机残差效应。计算数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 基因型分析PCR产物有1个BsmⅠ酶切位点,经BsmⅠ限制性内切酶酶切,出现3种带型在琼脂糖凝胶上显示为3条带(349 bp、195 bp和154 bp)的为TC基因型,2条带(195 bp和154 bp)的为TT基因型,表明PCR扩增片段被BsmⅠ切开；未被BsmⅠ切开的为CC基因型。

图1 淮猪新品系ECI1基因Bsm I酶切结果(部分)

2.2 ECI1位点多态性在淮猪新品系中的分布由表1可知,ECI1基因T等位基因频率为0.661,为淮猪新品系的优势等位基因,由于淮猪新品系Ⅱ系正处于选育中,所以卡方检验该位点处于哈代温伯格非平衡状态(P＜0.05),TT基因型频率为0.49,高于其他2种基因型。

表1 淮猪新品系II系(二世代)ECI1基因的基因频率及基因型频率分布

2.3 基因型与背膘厚的相关性分析ECI1基因CC型比TC、TT型个体的背膘厚分别高1.02、1.62 mm,分别达到显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)水平,而TC和TT基因间差异不显著(P＞0.05),见表2。

表2 不同基因型淮猪背膘厚

3 讨论

哺乳动物体内1/2以上的脂肪酸为不饱和脂肪酸,需要∆3-∆2-烯酸-辅酶A异构酶(ECI1)催化使其生成2-反烯脂酸辅酶A才进入下一步反应,因此猪体内脂肪沉积很大程度上取决于ECI1基因的表达与调控［15］。前期研究发现,ECI1基因实时定量PCR和蛋白表达在中国地方猪种(滇南小耳猪、淮猪等)和国外瘦肉型猪(大白、长白)间存在显著差异(数据未发表)由此提示,ECI1基因极有可能是调控猪脂肪沉积的重要基因,但关于猪ECI1基因研究尚未见报道。利用我国地方优良品种遗传资源对当前经济“不利”性状进行改良具有重要意义,淮猪新品系猪具有产仔数高、生长快、肉质优等特点,但与大白猪及长白猪相比存在背膘较厚的缺点［16］。ECI1基因型与淮猪新品系猪背膘厚的相关性分析表明,ECI1基因intro3-C54T位点对淮猪新品系的背膘厚具有显著影响,ECI1基因的优势基因为T等位基因,TT为优势基因型,由于淮猪新品系正处于选育中,猪群体内部不同基因位点的分离是必然的,卡方检验ECI1基因位点在群体中处于哈代温伯格非平衡状态。前期SNP研究结果显示,淮猪群体中该位点为C,大白及长白为T,而这也符合淮猪新品系含淮猪血统25%、长白血统25%、大约克血统50%的事实,所以选种时应提高T等位基因的频率,可以选择TT基因型个体进行留种以降低猪群的背膘厚、加速新品系的选育进程。

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Polymorphisms of ECI1 Gene and Association with Backfat Thickness in New Huai Fattening Pig Line Group

LU Yun-feng1,2,LI Qing-gang3,WANG Zhi-xiu2,ZHANG Bo2,WU Ke-liang2,ZHANG Hao2*
（1.School of Life Science&Technology,Nanyang Normal University,Henan Nanyang 473061,China；2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100193,China；3.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Anhui Hefei 230031,China）

The purpose of this research was to analyze genetic relationship betwee n ECI1 gene polymorphisms and backfat thickness of new huai pig line group.Two hundred and eight-six second generation sows ofⅡtype of new huai line of pigs were genotyped at intro3-C54T of ECI1 by using PCR-RFLP.Association analysis was performed to evaluate the correlation of the ECI1 polymorphism with the backfat thickness.In the New Huai fattening Pig Line sow group,the individual number of genotype CC,CT and TT were 48,98 and 140 respectively,and the genotypedistribution was not conform to the expected equilibrium（χ2=15.069,d.f.=1,P＜0.05）due to the population was selected from foundational breeding group.The mean backfat thickness of individuals with genotype CC was higher than those individuals with genotypes TT（P＜0.01）and CT（P＞0.05）.This study convinced the ECI1 have significant effects on the backfat thickness and provided basic data for ECI1 may be used as molecular genetic marker in New Huai line of pigs.

ECI1；backfat thickness；New Huai pig line

S828.2

A

0258-7033（2015）09-0001-03

2014-10-06；

2014-10-28

国家科技支撑计划（2012BAD3B03）；南阳师范学院高层次人才科研启动费资助项目（ZX2014071）

鲁云风（1980-），男，河南信阳人，博士，讲师，主要从事分子生态方面的研究，E-mail：yunflu@163.com

*通讯作者：张浩，副研究员，主要从事动物遗传资源与功能基因组研究，E-mail：zhanghao827@163.com