不同去核方法对猪手工克隆重构胚发育效果的影响

吕玲燕，陆杏蓉，孙俊铭，潘翠玲，崔奎青*，谢炳坤*

（1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，广西南宁530001；2.广西大学亚热带生物资源保护利用国家重点实验室，广西南宁530005）

不同去核方法对猪手工克隆重构胚发育效果的影响

吕玲燕1，陆杏蓉2，孙俊铭2，潘翠玲1，崔奎青2*，谢炳坤1*

（1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，广西南宁530001；2.广西大学亚热带生物资源保护利用国家重点实验室，广西南宁530005）

为探讨不同去核方法对猪手工克隆（HMC）重构胚发育效果的影响，本研究比较了盲切法，第一极体（Pb1）定位法及脱羰秋水仙碱（DM）辅助去核法3种不同的去核方法的去核效率及HMC胚胎发育的影响。结果表明：第一极体定位法和DM辅助去核法的整体去核效率显著高于盲切法去核法（P＜0.05）；应用0.4 μg/mL DM处理卵母细胞60 min的突起率、整体去核效率显著高于其他浓度和时间处理组（P＜0.05）；DM辅助去核与pb1定位去核法2种不同去核方法对HMC重构胚的发育效果的影响差异不显著。本研究表明，添加适量的DM可以提高徒手克隆去核效率，且对后期重构胚发育没有显著影响。

去核方法；猪；手工克隆；发育效果

自从“多莉”问世后,体细胞核移植技术不断向前发展,并在优秀动物个体复制、濒危动物保护以及细胞分化研究中取得一些举世瞩目的成就,它已然成为生命科学研究的热点领域之一。由于猪在生理、形态上与人的器宫非常相似,近年来应用猪的体细胞核移植技术研制人类基因疾病的动物模型,以及生产基因敲除猪用于人异种器宫移植成为猪核移植相关研究的热点方向之一［1-2］。就猪的体细胞核移植而言,成功克隆出小猪的概率总体只有1%,极大制约核移植克隆猪相关工作的开展［3-4］。卵母细胞的成功去核是克隆成功的第1步,影响去核的效率也是多方面的,如去核的干净程度、对卵胞质损伤类型及程度。DM具有破坏微管稳定、干扰染色体的正常分离和纺锤体的功能,可以促使激活卵母细胞核内的所有染色质随同极体一起排出,从而获得核移植所需的受体胞质,因此被用于卵母细胞的去核［5］。Gasparrini等［6］用DM进行化学诱导去核,以去核后小鼠卵母细胞为受体重构胚胚胎进行移植后成功获得了健康的克隆小鼠。Lan等［7］用DM辅助羊卵母细胞的去核,从而改善羊重构胚胎的发育潜能。Li等［8］用DM诱导去核的猪卵母细胞为受体的重构胚移植后成功获得了健康克隆小猪。由此可见,DM诱导去核的细胞质能够支持供体全基因组的重编程,可以用于体细胞核移植。本试验探讨不同去核方法对去核效率的影响,以及不同的去核方法对猪手工克隆重构胚发育潜能的影响,从而优化猪HMC的技术体系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂耗材培养液中的TCM-199粉剂、DMEM粉剂购置于美国Gibco公司,胎牛血清(FBS)购置于Hyclone公司,激素为hCG,eCG购置于美国Sigma公司,其余的化学试剂如无特殊说明均购自美国Sigma Aldrich公司。配制溶液的三蒸水均为南宁本地水。融合槽型号：BTX 450(San Diego,USA),卵母细胞成熟培养皿：35 mm及60 mm塑料平皿(BD Falcon,USA)自制卵母细胞切割刀,胚胎培养皿：匹孔板(NUNC公司,舟麦)胚胎积聚针(DN-10式)。

1.2 卵母细胞的成熟培养卵巢从南宁市附近的屠宰场获取,装入含有双抗(青霉素、链霉素)的生理盐水中,用保温壶4 h之内送回实验室。用手术剪剪掉卵巢上多余的结缔组织,再用37℃的生理盐水把卵巢冲洗干净,然后加入37℃含双抗的生理盐水,送到胚胎室抽取卵母细胞。用10 mL的注射器抽取卵巢表面2～6 mm的卵泡,卵泡液放入恒温架的试管中,静置15 min,弃去上清,用洗卵液分装沉淀的部分。在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上有颗粒/卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(COCs),放入成熟液中培养(含10 IU/mL h CG+ 10 IU/mL eCG),培养20～22 h后换成不含激素的培养液继续培养18～20 h。

1.3 胎儿成纤维细胞的培养胎儿从南宁屠宰场已怀孕母猪获取的,置于加双抗的生理盐水中,在4 h之内送回实验室。先用不含双抗的普通生理盐水清洗3遍,转移至无菌超净台,用眼科剪分离出部分大腿及臀部组织,之后用含有双抗的PBS清洗2遍,放入60 mm的无菌平皿底部,将其剪碎成2～3 mm大小的组织块,往培养皿中加入适量含10%FBS的DMEM培养液,用镊子将组织块均匀地铺开,在皿盖作好标记,将其倒扣于37℃、5%CO2培养箱中,4 h后加入少量培养液,防止组织块漂浮。24 h后在平皿底部加满培养液,48 h后继续观察胎儿成纤维细胞的生长状况,待原代成纤维细胞生长至90%左右汇合时传代,传至5～6代,用作猪手工克隆供体细胞。

1.4 卵母细胞的去核方法挑选优质的卵母细胞置于1%透明质酸酶中,轻轻吹打数次以去除包被在外层的颗粒细胞。然后将其移入的链霉蛋白酶溶液中,透明带开始变形时,立即移入含胎牛血清为20%的洗液(T20)中洗涤3次,然后放入T20中让其自然恢复成圆形,用口径约为200～300 μmol/L的玻璃吸管将卵母细胞转移至切割液(含2.5 μg/mL CB)中,挑选恢复完整、质量较好的卵母细胞用于去核。

盲切法：将恢复完整的卵母细胞置于体视显微镜下,用自制切割刀随机把细胞切成两半,Hoechst 333342染色去核,挑取无核细胞待用。

极体定位法：挑取具有第一极体的细胞,将极体置于06：00或12：00的位置,用切割刀切去极体方向约1/3的卵胞质,剩下的无核胞质留做后续试验。

化学辅助去核：将挑选出的卵母细胞放入DM中孵育DM的浓度、处理时间根据试验设计而定),将突起或极体至于06：00点或12：00的方位,利用自制的切割刀以压铡刀似的手法切去含突起或极体约1/3的胞质,留下2/3的胞质用作受体胞质。

1.5 供/受体细胞的融合/激活采用一步融合法。融合/激活分为3步,首先进行粘合,然后再进行融合/电激活,最后进行化学激活。

粘合：先用植物凝集素(PHA)把无核半卵和供体细胞粘合,形成半卵-供体细胞配对物；然后再把另一个去核半卵与配对物相粘合,形成卵-供体-卵式的粘合体,移入电融合液中待融合。

融合/电激活：将粘合体均匀放入有电融合液的融合槽中,电融合参数为AC：6 V/cm；DC：1.2 kV/cm, 30 μs,2 DC。电激活后完成后放入培养箱中恢复30 min,然后检查其融合情况。

化学激活：将融合后的重构胚放入含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX的PZM-3激活液中激活,每滴激活液中放入1枚重构胚,激活4 h。

1.6 重构胚的微穴培养为保证无透明带的HMC重构胚能够在相对独立的环境下生长,本研究采用微穴培养法对胚胎进行培养,微穴(WOW)制作过程如下：用胚胎聚集针在匹孔板里扎出底部光滑、宽度适中的“U”型穴,使卵裂球在穴底能够聚集在一起,便于到发育后期发生致密化形成囊胚。进行微穴培养时,每个孔扎30个穴左右为宜,密度适中,以便于胚胎发育过程中维持细胞间的联系。扎好微穴后的匹孔板用胚胎培养液(PZM-3)清洗2～3遍除去塑料碎屑后,加入500 μL猪胚胎培养液(PZM-3),并盖上500 μL矿物油。将已进行化学激活4 h的重构胚移入微穴(WOW)中,于38.5℃,5%CO2饱和湿度培养箱中进行重构胚胎培养,48 h观察卵裂率,160～168 h观察囊胚率。

1.7 囊胚细胞计数收集第7天的囊胚,于CCM细胞洗液中清洗2～3次后,置于的10 μmol/mL Hoechst33342染液,室温中避光染色15 min,取出于CCM中清洗2～3次,石蜡-凡士林封片,荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目,每一组均统计10个囊胚以上。

1.8 试验设计试验1：比较盲切法、第一极体定位法、DM辅助去核法3种方法对去核成功率的影响；试验2：比较0.3、0.4、0.5 μg/mL 3种DM浓度处理对去核效率的影响,探索DM处理的最佳浓度；试验3：比较用0.4 μg/mL DM处理0、30、45、60、90 min 5个时间对去核效率的影响,探索DM处理的最佳时间；试验4：探索DM处理对HMC重构胚发育效果的影响。

1.9 统计分析所得数据由SPSS17.0软件进行统计分析,试验每重复1次均为同一批次试验,使用相同来源的卵巢和试验条件,所有试验至少重复4次。

2 结果

2.1 3种不同去核方法对去核成功率的影响比较盲切法、第一极体定位法、DM辅助去核法3种不同去核方法对去核效率的影响。结果表明,第一极体定位法和DM辅助去核法的整体去核效率要高于盲切法去核,它们两者之间的去核效率差异不显著,具体结果见表1及图1。

表1 不同去核方法对去核效率的影响

图1 3种不同去核方法对去核效率的影响

2.2 3种不同DM浓度处理对去核效率的影响比较了0.3、0.4、0.5 μg/mL 3种不同浓度DM处理卵母细胞后对去核效率的影响,结果表明,0.4 μg/mL DM处理卵母细胞的突起率、整体去核效率显著高于其他浓度处理组,结果见表2。

2.3 0.4 μg/mL DM处理不同时间对去核效率的影响比较了0.4 μg/mL DM处理卵母细胞0、30、45、60、90 min对去核效率的影响,结果表明,DM处理卵母细胞60 min的突起率、整体去核效率最高,显著高于其他处理时间组(P＜0.05),其他各时间处理组之间的突起率、整体去核效率差异不显著(表3)。

2.4 DM处理对HMC重构胚发育效果的影响由表4和图2可见,0.4 μg/mL DM辅助去核法与Pb1定位去核法对HMC重构胚的发育效果的影响不大,两者之间卵裂率、囊胚率以及细胞计数差异不显著。

3 讨论

3.1 不同去核方法对去核效率的影响第一极体定位去核是比较原始、直接的去核方法,由于猪的卵母细胞胞质中沉积了大量的脂肪滴,使得在卵母细胞的去核过程中对胞质、第一极体、染色体结构的观察受到一定的阻碍,后来人们研究发现了可借助一些特定的化学物质辅助去核的方法,如盲切法结合荧光染料Hoechst33342染色去核和DM化学诱导辅助去核等。第一极体定位去核对卵胞质的物理及化学损害比较小,但去核过程需要仔细寻找第一极体,比较耗时,效率偏低,部分卵母细胞的第一极体脱落也造成整体去核率偏低。Dominko等［9］用第一极体定位去核,含透明带的卵母细胞的去核的率达70%,与本试验的去核效率基本一致。盲切法结合荧光染料Hoechst33342染色去核,它是卵母细胞随机切割去核后与荧光染料Hoechst33342共孵育,经过短暂的紫外线照射后把含有染色体的半卵胞质去除,留下另一半不含染色体的胞质待用,但荧光染料特异性地结合DNA是否具有潜在的危害有待证实。DM化学诱导辅助去核,它能借助DM能松弛细胞骨架,用它处理MⅡ期的卵母细胞能使染色质或核能突出于细胞表面,利用突起的位置可以定向、准确的去核［10］。Li等［11］在猪手工克隆中,用0.4 μg/mL的DM处理成熟41～42 h的卵母细胞45 min,结果表明,化学辅助去核的总体去核率、融合率及囊胚发育率明显高于定向切割去核的。李向臣等［12］利用DM突显牛卵母细胞的染色体进行定向去核,在浓度为0.5 μg/mL DM中孵育2 h,其显核率达到76.54%。任子利等［13］研究发现,切割成功率随着猪卵母细胞成熟时间的延长有上升趋势,成熟44 h和46 h组的切割成功率分别为83.68%和86.73%,高于40 h和42 h组(77.84%和82.97%,P＞0.05)。本试验的3种去核方法中,DM辅助去核的效率较高,与上述文献的试验结果相符。

表2 不同DM浓度处理对去核效率的影响

表3 0.4 μg/mL DM不同处理时间对去核效率的影响

表4 DM处理对HMC重构胚发育效果的影响

3.2 0.4 μg/mL DM处理不同时间对去核效率的影响DM与卵母细胞的共孵育时间对去核是至关重要的。孵育时间过短,第一极体无法凸显；孵育时间太长,DM又可能影响去核后重构胚的发育。任子利等［13］研究表明,0.4 μg/mL DM处理成熟44 h的猪卵母细胞1 h与0.5 h,1.5 h相比,卵裂率差异不显著,囊胚率略高于其他时间处理组。Li等［11］用0.4 μg/mL的DM处理卵母细胞45 min,与随机切割去核,显微操作去核相比,其总体去核率、囊胚发育率都要高于其他去核方法。孙伟［14］研究表明,0.4 μg/mL DM处理牛MII卵母细胞60 min的诱导去核效率高达84.19%,与本研究结果一致。

3.3 DM处理对HMC重构胚发育效果的影响DM诱导去核及Pb1定位去核后的受体是否影响重构胚胎的后续发育过程有待验证。去核过程损失过多的胞质会影响重构胚的发育能力及囊胚细胞总数。Bowles等［15］通过分别融合去核后的1、2、3个半卵胞质,比较后期囊胚的发育率,结果分别为9.9%、28.2%、30%,这说明重构胚的体积对胚胎的后续发育具有至关重要的作用。Siriboon等［16］把发育到4细胞阶段的手工克隆胚胎,通过2个4细胞阶段和3个4细胞的胚胎聚合,增加胞质的体积,从而提高胚胎发育效率,改善胚胎的发育质量。Li等［17］研究表明在以转基因的成纤维细胞为供体的HMC试验中,pb1定位去核后受体重构胚的发育潜能要略优于DM辅助去核的重构胚发育潜能。本试验比较了DM诱导去核及pb1定位去核后的受体对重构胚胎发育效果,结果表明2种去核方法的HMC重构胚发育效果差异不显著,可能是由于去核过程对卵母细胞胞质造成的损伤是相当的,而且都不影响后续胚胎的发育效果。

图2 A、B分别为DM辅助去核后的HMC囊胚及Hoechst 33342染色后的囊胚细胞，C、D分别为Pb1定位去核后的HMC囊胚及Hoechst 33342染色后的囊胚细胞数

4 结论

第一极体定位法和DM辅助去核法的整体去核效率要高于盲切法去核；0.4 μg/mL DM处理卵母细胞60 min的突起率、整体去核效率最高,显著高于其他浓度和时间处理组；DM辅助去核与Pb1定位去核2种不同去核方法对HMC重构胚的发育效果的影响差异不显著。

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Effects of Developmental Potency of Reconstructed Embryos on Pig Handmade Clone with Different Enucleation Methods

LV Ling-yan1,LU Xing-rong2,SUN Jun-ming2,PAN Cui-ling1,CUI Kui-qing2*,XIE Bing-kun1*
（1.Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement,Guangxi Institute of Animal Sciences,Guangxi Nanning 530001,China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources Guangxi University,Guangxi Nanning 530005,China）

Effects of developmental potency of reconstructed embryo on pig handmade clone（HMC）with different enucleation method was investigated.In this study,we compared with enucleation efficiency and effect of HMC embryos developmental potency by three different methods with blind cut method,first polar body positioning method（Pb1）and demecolcine（DM）assistance method.The results showed that overall enucleation efficiency of Pb1 positioning method was significantly higher than blind cut method（P＜0.05）.Protuberance rate and overall enucleation efficiency of 0.4 μg/mL DM treated group for 60 min was significantly higher than other concentration and time treatment groups（P＜0.05）.Developmental potency of HMC reconstructed embryos by DM assistance method and Pb1 positioning method had no significant difference.In conclusion,this study indicated that appropriate amount addition of DM could enhance enucleation efficiency of HMC,however,it wasn't significantly effects on developmental potency of reconstructed embryos.

enucleation methods；porcine；handmade clone；developmental potency

S828.3

A

0258-7033（2015）09-0016-05

2014-10-14；

2014-12-05

国家自然科学基金（31360544）；广西畜牧研究所基本科研业务费项目基金（桂牧研科2014-02）

吕玲燕（1985-），女，广西桂林人，硕士，主要从事动物胚胎工程和分子遗传育种研究，E-mail：llyan159@163.com，第二作者跟第一作者具有相同的贡献，故并列第一作者

*通讯作者：崔奎青，教授，kqcui@126.com；谢炳坤，副研究员，bkxie@163.com