杏鲍菇多孢分离菌株ISSR、RAPD分子标记及体细胞不亲和性分析

王小艳，王春晖，姜性坚，陆 欢，徐 宁，胡如晓，李新菊

（湖南省食用菌研究所，湖南 长沙 410013）

杏鲍菇多孢分离菌株ISSR、RAPD分子标记及体细胞不亲和性分析

王小艳，王春晖，姜性坚，陆 欢，徐 宁，胡如晓，李新菊

（湖南省食用菌研究所，湖南 长沙 410013）

通过杏鲍菇多孢分离菌株的ISSR、RAPD分子标记和体细胞不亲和性分析，体细胞不亲和性分析得出子代杏1、杏3、杏4与出发菌株湘杏98有拮抗线，杏1、杏2、杏3、杏4四株子代均有明显的拮抗线。16条ISSR引物和19条RAPD引物分别扩增出99、154个条带，多态性条带分别占48.48%、61.00%；相似系数变异范围分别为0.63～0.86、0.57～0.83。湘杏98、杏2、杏3在2种标记的聚类结果上存在差异。体细胞不亲和性分析从表型上（拮抗线有无）反应了菌株的遗传变异。RAPD标记遗传相似系数小于ISSR标记，表明ISSR标记更适合亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析。

杏鲍菇；ISSR；RAPD

体细胞不亲和性分析—拮抗反应，该方法操作简单，检测效果直观明了，为食用菌异宗结合种类遗传特异性鉴定最常用的方法。RAPD（随机扩增多态性DNA）和ISSR（简单序列重复间）分子标记具有操作简单、模板需求量少、引物容易得到和不需要知道被检基因组序列等优点，被广泛用于杏鲍菇品种间亲缘关系及亲本与杂交菌株遗传多样性检测。冯伟林等[1]应用ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异，得到杏鲍菇生产菌株间的ISSR标记指纹图谱，构建受试菌株间的遗传亲缘关系模型。刘晓红[2]利用ISSR分子标记技术辅助杏鲍菇常规杂交育种，ISSR被用于杏鲍菇育种材料亲缘关系鉴定及杂交后代与亲本遗传多样性检测。尚晓冬等[3]对从国内外收集到的19株杏鲍菇菌株进行随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，结果表明RAPD分析所得的遗传相似性结果和体细胞不亲和性分析，栽培所得的子实体形态结构均比较接近。

本文采用体细胞不亲和性分析，ISSR、RAPD分子标记技术分析分别对供试材料进行检测，检测分析与验证菌株的遗传多样性及亲缘关系，为杏鲍菇新品种选育种质资源的鉴定提供准确的数据。同时，通过对供试材料的体细胞不亲和性与分子标记及分子标记结果进行比较，筛选一种适合亲缘关系较近品种内分子检测方法。

1 材料与方法

1.1试验菌株

试验菌株亲本为湖南省春华生物科技有限公司杏鲍菇工厂生产菌株湘杏98，由湖南省食用菌菌种保藏中心提供，杏1、杏2、杏3、杏4菌株为湘杏98多孢分离子代。

1.2杏鲍菇不同菌株体细胞不亲和性试验

先将试验菌株活化，每个菌株在培养皿上接种2个点，放入恒温培养箱25℃培养，菌丝生长过程中观察拮抗反应情况。

1.3菌丝体培养及DNA的提取

将活化后的供试菌株接入PDA液体培养基，置于摇床中培养，摇床转速为150 r·min-1，培养温度25℃，10 d后，选取长势好的供试菌丝体用无菌水清洗菌丝2次，用无菌滤纸吸干菌丝体上水分，菌丝采用400目铜网收集，-70℃保存备用。DNA提取采用CTAB法[4]，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃保存备用。

1.4随机引物筛选及其反应体系

ISSR随机引物筛选及其反应体系参照冯伟林等[1]使用方法：在60个ISSR随机引物中筛选出16个条带清晰、反应稳定的引物用于ISSR-PCR扩增。

RAPD随机引物筛选及其反应体系参照陈学军等[5]使用方法：从60个引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物19个进行RAPD分析。

1.5PCR反应产物的检测

PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离1.5 h，电压为10 V·cm-1，0.5 μg·L-1的溴化乙锭染色，待溴酚兰距凝胶前缘1 cm左右停止电泳，Olympus C-740数码相机拍照，反应产物以Gene RulerTMDNA LadderMix为DNA Marker，估测分子量大小。

1.6数据分析

根据某一条谱带在样品中的出现和不出现分别赋值为1和0，统计各菌株的扩增条带数，用NTSYSpc2.1专业版软件计算遗传相关系数，采用平均连锁法UPGMA进行聚类分析，得出聚类图谱。

2 结果与分析

2.1供试菌株菌丝间的拮抗试验

供试菌株亲本与孢子自交子代菌株间的拮抗关系见图1。

图1 亲本与子代拮抗线Fig.1 Parents and offspring antagonistic line

从图1可知，亲本湘杏98与其孢子自交子代杏2拮抗反应不明显，表明自交子代杏2与亲本二者亲缘关系较近。杏1、杏3、杏4与亲本间均存在明显拮抗线，表明3个自交子代与亲本间存在不同的遗传特性。自交子代菌株间拮抗结果见图2。

图2 间拮抗线Fig.2 Tagonism between progeny lines

从图2可知，自交子代间都存在明显的拮抗线，表明子代菌株间的遗传特异性。

2.2不同菌株间ISSR分析

16条引物的ISSR电泳图谱见图3。

对60条ISSR引物进行了筛选，其中有16条引物（811、812、816、823、825、826、827、834、835、836、840、866、868、873、876、880） 能扩增出条带清晰且具多态性的带谱，共计扩增出99条清晰易辨的多态性DNA片段条带，其中48条为多态性带，多态性百分比为48.48%。结果显示5个杏鲍菇菌株的遗传相似系数变异范围为0.63～0.86，遗传差异变化较大，见表1。

图3 不同引物扩增图谱Fig.3 Different primer Fingerprints

表1 供试菌株基因间ISSR相似性系数矩阵Tab.1 Genetic identity of strainswith ISSR method

从表1可以看出，亲本湘杏98与孢子分离子代杏1遗传差异最大，相似系数为0.70，杏4次之，相似系数为0.72，与杏2、杏3遗传差异稍小些，相似系数分别为0.84、0.86。孢子分离子代间遗传差异显著，杏1与杏3遗传差异最大，相似系数仅为0.63，杏3与杏4次之，相似系数为0.67，杏1与杏2相似系数为0.69，杏2与杏3遗传差异相对较小，相似系数最高为0.85。

将5个杏鲍菇菌株的遗传相似系数，采用平均连锁法UPGMA进行聚类分析，构建出5个杏鲍菇菌株的遗传亲缘系数树状图，见图4。

图4 5个供试菌株的ISSR聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of 5 accessions strains with ISSR method

从图4可以看出，供试5个杏鲍菇菌株在相似系数为0.69时聚在一起，相似系数为0.76时聚为3个群。其中，亲本湘杏98与子代杏2、杏3菌株聚为类群Ⅰ，其中亲本湘杏98与子代杏3亲缘关系最近，子代杏1菌株单独聚为类群Ⅱ，子代杏4菌株单独聚为类群Ⅲ。

2.3不同菌株间RAPD分析

不同引物的扩增图谱见图5。

图5 不同引物扩增图谱Fig.5 Different primer fingerprints

对60条RAPD引物进行筛选，其中有19条引物（S22、S24、S27、S28、S36、S39、S43、S64、S75、S78、S79、S126、S159、S242、S370、S484、S485、S2056、S2059） 能扩增出条带清晰且具多态性的带谱，共扩增出154条清晰易辨的多态性DNA片段条带，94条为多态性带，多态性百分比61.0%。

5株杏鲍菇菌株的遗传相似系数变异范围为0.57～0.83，遗传差异变化较大，见表2。

由表2可见，亲本湘杏98与孢子分离子代杏4遗传差异最大，相似系数为0.57，杏1次之，相似系数为0.64，与杏2、杏3遗传差异稍小些，相似系数分别为0.70、0.72。孢子分离子代间遗传差异显著，杏2与杏4遗传差异最大，相似系数仅为0.62，杏2与杏4次之，相似系数为0.66，杏2与杏3遗传差异相对较小，相似系数最高为0.83，杏1与杏2、杏3、杏4的相似系数相差不大分别为0.72、0.72、0.76。

应用UPGMA聚类法，构建出5个杏鲍菇菌株的遗传亲缘系数树状图，见图6。

表2 供试菌株基因间RAPD相似性系数矩阵Tab.2 Genetic identity of strainswith RAPD method

图65 个供试菌株的RAPD聚类分析图Fig.6 Cluster analysis of 5 accessions strains with RAPD method

从图6可以看出，供试5个杏鲍菇菌株在相似系数为0.66时聚在一起，相似系数为0.70时聚为2个群，其中亲本湘杏98与子代杏2、杏3菌株聚为类群Ⅰ，子代杏1、杏4菌株聚为类群Ⅱ。相似系数为0.78时聚为4个群，湘杏98聚为类群Ⅰ，杏2、杏3菌株聚为类群Ⅱ，杏1菌株单独聚为类群Ⅲ，杏4菌株单独聚为类群Ⅳ。

3 讨论

菌丝之间的拮抗反应是菌株间不同遗传特性的重要表现，不同的种、种内不同的菌株之间，接种在同一平板上，经过培养，会形成拮抗线。多孢分离部分子代与亲本存在拮抗线，表明多孢分离可以获得遗传变异株。ISSR结果显示，亲本与多孢挑选子代相似系数为0.70～0.86，相似系数低于冯伟林[1]

从不同产区收集到品种ISSR分子标记分析遗传相似系数变异范围（0.68～0.99）。PAPD结果显示亲本与多孢挑选子代相似系数为0.57～0.72，与尚晓冬[3]从国内外收集到的供试的19株杏鲍菇菌株间RAPD图谱相似系数（0.448～0.857）结果一致。试验结果表明，拮抗线反应出多孢分离菌株在遗传上发生了变异，ISSR与PAPD标记量化了遗传差异的程度，证明杏鲍菇多孢分离从遗传变异角度作为新品种选育是可行的，但尚不能说明多孢子代为选育的优良菌株，还有待进一步进行多孢分离菌株产量、品质、抗性等特性出菇试验检测。

供试子代杏2与亲本间无拮抗线，但ISSR与PAPD标记检测结果均显示杏2与亲本间存在差异，与亲本相似系数分别为0.848、0.707，为不同的遗传菌株，结果表明拮抗线能从表型上反应出部分遗传差异远菌株间的遗传差异，但不能反应遗传差异较小菌株间的遗传差异，对于遗传差异较小的菌株需采用分子标记方法检测。

比较ISSR、PARD技术对供试菌株的检测结果，两种标记的多态性和检测水平各不相同。RAPD标记应用于杏鲍菇亲本与子代、子代与子代亲缘关系检测的平均多态性条带数和比率均高于ISSR标记，相似系数小于ISSR标记。说明RAPD标记和ISSR标记均可用于杏鲍菇种质遗传多样性的检测，但ISSR标记比RAPD标记可检测遗传多样性的能力更高，更适于亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析。

[1]冯伟林，蔡为明，金群力.ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究[J].中国食用菌，2009，28（1）：47-49.

[2]刘晓红，蔡为明，叶爱华，等.杏鲍菇种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].安徽农业科学，2009，37（32）：78-79.

[3]尚晓冬，宋春艳，谭琦，等.杏鲍菇菌株RAPD指纹图谱分析[J].食用菌学报，2009，16（3）：1-4.

[4]宿红艳，王磊，刘林德.RF-RAPD分子标记在杏鲍菇菌株鉴定上的应用[J].食品科学，2008，29（3）：264.

[5]陈学军，程志芳，陈劲枫，等.辣椒种质遗传多样性的RAPD和ISSR及其表型数据分析[J].西北植物学报，2007，27（4）：662-670.

Analysis on Multi-spore Isolated Pleurotus eryngii Using ISSR and RAPD Molecular Markers and Somatic Incompability

WANG Xiao-yan,WANG Chun-hui,JIANGg Xing-jian,LU Huan,XU Ning,HU Ru-xiao,LI Xin-ju
(Hunan Provincial Institute of Edible Fungus,Changsha 410013,China)

ISSR,RAPD molecular marker and somatic incompatibility were used to analyze the multi－spore isolated Pleurotus eryngii.The result of somatic incompatibility showed that xing1,xing3,xing4 and parents xiangxing98 had antagonistic barrage, the barrage formation were apparently among xing1,xing2,xing3,xing4.16 ISSR primers and 19 RAPD primers combinations amplified 99,154 bands,respectively,polymorphic bands accounted for 48.48%,61.00%,the genetic similarity coefficient was 0.63～0.86,0.57～0.83,respectively.The clustering results of Xiangxing98,xing2,xing3 was different between the two clustering analysis.Analysis of somatic incompatibility reflected the genetic variation of strains on the phenotype (barrage had or not). The result of genetic similarity coefficient based on RAPD was lower than those based on ISSR.The results were indicated that ISSR marker was more suitable for analysis genetic diversity of close genetic relationship population.

Pleurotus eryngii;ISSR;RAPD

A

1003-8310（2015）03-0057-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.014

王小艳（1980－），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌菌种保藏、品种选育方面研究。E－mail:wangxiaoyan1206@sohu.com

2015－02－16