不同条件对银耳芽孢及其多糖产量影响*

阮玲云，苏达龙，单书凯，李 哲，李钊锋，胡开辉，孙淑静

（福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002）

不同条件对银耳芽孢及其多糖产量影响*

阮玲云，苏达龙，单书凯，李 哲，李钊锋，胡开辉，孙淑静**

（福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002）

银耳芽孢不仅可作为新型生物反应器生产外源药用蛋白，其多糖也具有重要药用价值，通过测定不同pH值、氮源、碳源、无机盐及营养饥饿等条件下银耳芽孢及胞内外多糖产量，探索各营养条件对银耳芽孢、多糖产量及分泌多糖能力的影响。结果表明，最适初始pH为5，碳源为麦芽糖，氮源为NaNO3，银耳芽孢和胞内外总多糖产量最高，与其它相同条件比较达到显著性差异，在以上单因素变化中，芽孢最高产量13.8 g/100mL，总多糖最高产量为145.31 mg/100mL。但蔗糖及NH4Cl有利于胞外多糖的产生。不同培养基成分实验结果表明，低氮及高无机盐不仅有利于芽孢的生长及多糖的产生，而且有利于多糖的分泌。

银耳芽孢；发酵；营养条件；多糖

银耳（Tremella fuciformis Berk.） 又称白木耳，在真菌分类学中，属于真菌门（Eumycota）、层菌纲（Hymenomycetes）、有隔担子菌亚纲（Heterobasidiomycetes）、银耳目（Tremellales）、银耳科（Tremel－laceae）、银耳属（Tremella）[1]。自古以来，银耳都被视为滋补食品。研究表明，银耳的主要药用成分是多糖，银耳多糖是从银耳子实体或芽孢中以热水浸提、酶提取法、碱浸提法及酶解提取法等[2-4]方法获得的活性多糖类物质，为担子菌多糖类免疫增强剂。众多研究结果表明，银耳多糖具有提高人体免疫功能、强心、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化等药理作用[5]，是一种较理想的滋补强壮剂。同时银耳芽孢多糖具有淬灭致病细菌群体感应的功能[6]。银耳多糖因其众多的保健作用日益受到各国人民的青睐，若仅靠子实体来提取显然速度不够，此时通过液体深层发酵技术进行大规模快速发酵生产多糖的银耳芽孢就显示出明显的优势[7-8]。胞外多糖（EPS）的产量受诸多因素影响，除与菌种的遗传特性有关，菌株培养基的营养成分和环境条件也会影响银耳芽孢多糖的合成。研究表明，pH、发酵方式、葡萄糖的添加等因素显著影响银耳芽孢生物量及胞外多糖产量[9-1 2]，因此，探索各可控条件对银耳芽孢及胞外多糖产量的影响，对提高银耳附加值及银耳多糖规模化生产具有重要意义，但营养缺乏及无机盐等条件对银耳芽孢产量及多糖分泌能力的影响未见报道。本实验通过不同营养条件对银耳芽孢产量及胞内外多糖产量影响的研究，为银耳芽孢改变营养条件调节芽孢产量、多糖产量以及作为生物反应器胞外物质分泌能力提供理论依据，同时对芽孢高效生产多糖、降低生产成本具有现实意义。

1 材料与方法

1.1材料

银耳芽孢菌株，由福建农林大学生命科学学院微生物工程实验室提供。

1.2仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；JY92-11D超声波破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；智能型生化培养箱（SPX），上海博讯实业有限公司；大容量双层全温摇床（QYC-2102），宁波江南仪器厂。

1.3供试培养基

PDA固体培养基：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20.0 g、琼脂粉20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

完全培养基：葡萄糖15.0 g、蛋白胨 2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，水1 000 mL，pH自然。

低氮培养基（1 L）：葡萄糖15.0 g、硝酸铵0.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

吐温20培养基（1 L）：在低氮培养基中加5.0 g，吐温20，pH自然。

高氮低碳培养基（1 L）：葡萄糖0.5 g、蛋白胨2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

高无机盐培养基（1 L）：葡萄糖15.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母膏 2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO42 g，pH自然。

低氮低碳低无机盐培养基（1 L）：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g，pH自然。

1.4方法

1.4.1 不同pH对银耳芽孢及多糖产量的影响

用HCl溶液和NaOH溶液将完全培养基pH值调至3、5、7、9四个梯度，取1 mL芽孢发酵液分别接种于装100 mL液体培养基三角瓶中，以未调pH值的完全培养基为对照，每个梯度3个重复。25℃、110 r·min-1的摇床中培养4 d。8 000 r·min-1离心10 min，分别收集上清液和银耳芽孢，芽孢用等体积的无菌水重复清洗3次，60℃烘至恒重,测芽孢产量。

1.4.2 不同碳源对银耳芽孢及多糖产量的影响

以完全培养基为基础培养基，将其葡萄糖分别换成1.5%的蔗糖、麦芽糖、乳糖作为碳源，起始pH为以上优化结果。取1 mL芽孢发酵液分别接种于装100 mL液体培养基三角瓶中，每个梯度3个重复。25℃、110 r·min-1的摇床中培养4 d，具体操作同上。

1.4.3 不同氮源对对银耳芽孢及多糖产量的影响

将完全培养基的氮源分别换成NH4Cl、NaNO3、尿素、NH4NO3，起始pH为以上优化结果，取1 mL芽孢发酵液分别接种于装100 mL液体培养基三角瓶中，具体操作同上。

1.4.4 不同营养条件对银耳芽孢及多糖产量的影响

取1 mL芽孢发酵液分别接种于完全培养基、低氮培养基、吐温20培养基、高氮低碳培养基、高无机盐培养基、低氮低碳低无机盐培养基（三低培养基）中，测芽孢重量及其多糖产量，具体操作同上。

1.4.5 胞内外多糖的提取及含量测定

取10 mL收集的上清液于50 mL离心管，加入3倍体积的无水乙醇，充分混匀后置于4℃冰箱过夜。第2天取出4℃、8 000 r·min-1离心10 min后弃上清，收集沉淀。准确称取3 g芽孢于50 mL离心管加入无菌水至20 mL，置于冰水浴中采用超声破碎（功率300 W，“1/2”探头，破碎3 s、间歇3 s，共破碎10 min）。将破碎液置于60℃水浴锅中水浴4 h后，4℃、8 000 r·min-1离心10 min。取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，充分混匀后置于4℃冰箱过夜。第2天取出4℃，8 000 r·min-1离心10 min，弃上清，收集沉淀，苯酚-硫酸法[13]测胞内外沉淀多糖含量。总多糖为胞外多糖和胞内多糖之和。

1.4.6 数据处理

数据采用DPS7.05软件进行单因素统计分析。

2 结果与分析

2.1不同pH对银耳芽孢及多糖产量的影响

未调pH值的完全培养基芽孢的产量为6.89 g/100mL，胞内多糖含量为20.34 mg/100mL，总多糖含量为24.64 mg/100mL。不同pH下芽孢和多糖产量测定结果见图1。

图1 起始pH值对银耳芽孢及多糖产量的影响Fig.1 Effect of different pH value on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由图1可知，pH对银耳芽孢产量和胞内外多糖产量有显著的影响。在pH为3时，芽孢生长受到较明显的抑制，胞内外多糖产量也极少。随着pH的升高，银耳芽孢生长都较好，胞内外多糖产量也明显增加。在pH为5时，银耳芽孢生长状况最好，芽孢产量和胞外多糖产量最高，分别为7.69 g/100mL和6.89 mg/100mL，与其它pH值的芽孢产量和胞外多糖产量相比达到显著性差异，这说明强酸和强碱条件均不利于银耳芽孢的生长及多糖的产生。

2.2不同碳源对银耳芽孢及多糖产量的影响

培养基的碳源主要用来供应生物体生命活动所需的能量，是构成细胞以及代谢产物的物质基础。本实验分别用麦芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖代替完全培养基中的葡萄糖，添加量为1.5%，培养基其它成分和配比不变，探究了不同碳源对银耳芽孢及多糖产量的影响，实验结果见图2。

图2 不同碳源对银耳芽孢及多糖产量的影响Fig.2 Effect of different carbon source on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

在二糖中，当以麦芽糖作为碳源时，银耳芽孢产量最高，为13.8 g/100mL，所产胞内多糖产量也最高，119.41 mg/100mL，总多糖产量为 145.31 mg/100mL，与完全培养基及其它碳源条件培养的银耳芽孢和胞外多糖产量相比达到显著性差异。芽孢也能较好的利用蔗糖并能促进胞外多糖的分泌，蔗糖作为碳源，胞外多糖含量是麦芽糖的1.6倍。以乳糖作为碳源时，芽孢生长及胞内外多糖产量均明显处于劣势。这可能是由于在用乳糖作为碳源培养时，银耳芽孢无法吸收而影响了银耳芽孢的生长，从而导致胞内外多糖产量较低。

2.3不同氮源对对银耳芽孢及多糖产量的影响

银耳芽孢对氮源种类的要求严格，蛋白胨是蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种多肽、氨基酸组成的水溶性混合物，它作为有机氮源由于成分复杂，所包含含氮类物质比较多，芽孢长势相对会比较好。本实验分别以NH4Cl、NaNO3、尿素、NH4NO3为氮源，比较芽孢及胞内外多糖产量，结果见图3。

图3 不同氮源对银耳芽孢及多糖产量的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由图3可以看出，氮源为NaNO3时，银耳芽孢产量最高，总多糖产量也最高，达80.36 mg/100mL，但胞外多糖产量很低，与其它氮源培养胞外多糖产量相比有显著性差异，说明NaNO3并不利于胞外多糖的分泌。以氯化铵为氮源时，胞外多糖产量较高。尿素和硝酸铵作为氮源时，对银耳芽孢产量影响显著，胞内多糖及总多糖产量相对都较低。

2.4不同营养条件对银耳芽孢及多糖产量的影响

碳源和氮源对银耳芽孢的生长及代谢影响较大，无机盐在芽孢代谢过程中也起到了重要的作用。本实验测试了5种不同培养基（低氮、低氮+吐温20、高氮低碳、高无机盐、三低）对银耳芽孢及多糖产量的影响，实验结果见图4。

图4 不同培养基对银耳芽孢及多糖产量影响Fig.4 Effect of different media on yield of spores and polysaccharide of T.fuciformis

由图4可以看出，高无机盐培养基中银耳芽孢产量最高，胞外多糖产量达113.16 mg/100mL，与其它条件银耳芽孢培养胞外多糖产量相比有显著性差异。低氮条件次之，其他3种条件下银耳芽孢产量几乎为零，多糖产量也较低。在碳源正常的情况下，低氮及高无机盐有利于银耳芽孢的生长、多糖的产生及胞外多糖的分泌。

3 结论与讨论

本文通过测定不同pH值、氮源、碳源、无机盐及营养饥饿等条件下银耳芽孢及胞内外多糖产量，探索各营养条件对银耳芽孢、多糖产量及分泌多糖能力的影响。结果表明最适初始pH为5时有利于银耳芽孢的产生以及胞外多糖的分泌，碳源为麦芽糖时有利于银耳芽孢的产生及总多糖产量的提高，但不利于胞外多糖的产生，氮源为NaNO3时银耳芽孢和胞内外总多糖产量最高，但胞外多糖产量低，蔗糖及NH4Cl有利于胞外多糖的产生。不同培养基成分实验结果表明，低氮及高无机盐不仅有利于芽孢的生长及多糖的产生，并能增强胞外多糖的分泌。以上研究结果虽然胞外多糖与朱虎等[11]报道最高产量5.8 g·L-1相差很大，但本研究结果对提高银耳附加值、胞外物质分泌能力及降低生产成本具有重要实际应用价值。

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Effects of Different Conditions on the Yield of Polysaccharides and Spores from Tremella fuciformis

RUAN Ling-yun,SU Da-long,SHAN Shu-kai,LI Zhe,LI Zhao-feng,HU Kai-hui,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Tremella fuciformis spores were used as new type bioreactor to produce foreign medical protein.At the same time the polysaccharides of T.fuciformis spores had many medical functions for human.The yields of spores and polysaccharides of T.fuciformis were determined under different conditions including different pH value,nitrogen sources,carbon sources and other medium components for exploring the effects of all kinds of conditions on the yields of spores and polysaccharides.The results showed the optimum pH,carbon and nitrogen sources for producing the maximum polysaccharide yield were respectively pH 5, maltose and NaNO3.Among the change of single factor,the yields of spores and polysaccharides were highest respectively 13.8 g/ 100mL and 145.31 mg/100mL.The production of exopolysaccharides (EPS)was higher using sucrose as carbon source and NH4Cl as nitrogen source.The low nitrogen content and high inorganic salts content were to benefit of spores production and polysaccharides,especially the production of EPS.

Tremella fuciformis;fermentation;nutritional condition;polysaccharide

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0047-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.012

福建省发改委农业五新工程项目，项目编号：闽发改委投资 [2012]931号；福建省自然基金杰出青年项目，项目编号：2014J06010；福建农林大学校杰出青年人才项目项目，编号：xjq201209；国家自然基金青年项目，项目编号：31201669；教育部博士点基金，项目编号：20103515120015。

阮玲云（1989－）女，在读硕士研究生，研究方向：食用真菌学。E－mail:rly2014@126.com

**通信作者：孙淑静（1978－），女，博士，副教授，主要从事食用真菌学方面研究。E－mail:shjsun2004@126.com

2015－03－10