基于cox1基因的贻贝科遗传差异及系统发育关系

朱明　孟学平　赵军　杨官品

摘要：基于线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚基1基因（cox1），分析贻贝科8个属中13个物种的种间、种内遗传差异及系统发育关系，结果表明，属间遗传距离为0.245～0.630，平均为0.487；同物种的母系和父系cox1遗传距离为0.21～0.24；新西兰绿唇贻贝与资料中的绿唇贻贝和Perna perna聚为1支，支持率为100%，后与翡翠贻贝聚为1支；13个物种中，除Trichomya hirsuta与贻贝属种类聚为1支外，其余各属均聚为单系支，贻贻属Mytilus、股贻贝属Perna、肌蛤属Musculista 3个属遗传关系近。

关键词：贻贝科；cox1基因；绿唇贻贝；遗传差异；系统发育

中图分类号： S917 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0023-05

贻贝科属于软体动物门瓣鳃纲贻贝目（Mytiloida），现有33个属约250个种[1]。新西兰绿唇贻贝Perna canaliculus（Gmelin，1791）、翡翠贻贝Perna viridis（Linnaeus，1785）隶属于贻贝科股贻贝属（Perna），紫贻贝Mytilus galloprovincialis （Lamarck，1819）属于贻贝属（Mytilus），翡翠贻贝和紫贻贝是我国主要养殖的2种贝类[2]。翡翠贻贝自然分布于西太平洋及印度洋热带和亚热带海域，我国主要分布在东海南部及南海；紫贻贝在世界上分布范围非常广，在我国被认为是1个外来种，目前南北沿海均有分布[3]；新西兰绿唇贻贝是股贻贝属中新西兰特有的1个物种，是新西兰的重要海产种质[4-5]，其脂溶性提取物有显著的抗炎作用，对慢性关节炎具有很好的疗效，在生活中得到广泛应用[6]，新西兰年养殖产值为1.90亿美元[7]。有关贻贝科物种群体遗传差异研究有许多报道[8-11]，如位正鹏等基于cox1基因研究了股贻贝属3种贻贝的系统关系[12]，刘君等研究了cox1基因在贻贝科鉴定中的应用[13]，叶莹莹等基于16S rRNA基因研究了厚壳贻贝4个群体的遗传结构[14]。有关绿唇贻贝幼虫附着变态的研究也有较多报道[7，15-16]，但绿唇贻贝的分子系统学研究未见报道。本试验通过扩增新西兰绿唇贻贝、翡翠贻贝和紫贻贝的cox1片段，研究其序列结构特点、序列差异水平，并结合GenBank检索到的贻贝科cox1序列，分析其系统演化关系，为生物入侵监测及贻贝科国际种质资源交流管理提供理论依据和技术手段，也为贻贝科类群的系统演化关系提供资料，对我国贻贝的养殖及绿唇贻贝的引种具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验样本

绿唇贻贝6个个体，采于新西兰奥克兰；翡翠贻贝18个个体，采于福建厦门；紫贻贝15个个体，采于江苏连云港。取闭壳肌备用。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

采用CTAB法裂解组织，酚-氯仿抽提、乙醇沉定法获得总DNA。绿唇贻贝和翡翠贻贝cox1片段长为750 bp，扩增所用引物为ACOIF：5′-CGDATTCARCTWTCTCAYCCHGG-3′和ACOIR：5′-AMMGTAAAYATRTGRTGMGCCC-3′；紫贻贝cox1片段为889 bp，扩增所用引物为Med-cox1-F：5′-TGGGGTCTGAGGAGGTTTGT-3′和Med-cox1-R：5′-CCCTGTAGGGACTGCGATTA-3′。PCR扩增程序：94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，35个循环；72 ℃延伸 1 min。反应体系为25 μL，Taq酶1～2 U。经琼脂糖凝胶电泳检测，将有效扩增PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司用ABI-PRISM 3730测序仪双向测序。

1.3 序列比对分析

测序获得的原始DNA序列用DNAStar软件包中的SeaMan软件组装，结合测序峰图进行人工校对，获得可靠的DNA序列；用ClustalX软件对DNA序列进行排序，将5′、3′端取齐，转换成 .meg文件；用DnaSP 5.0软件检测单倍型，用Mega 4软件分析序列特征，计算遗传距离，构建NJ （K2-P法）系统进化树，进行遗传差异分析；GenBank中检索贻贝科cox1序列资料，与本试验序列资料一起分析贻贝科属间、种间遗传差异及系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 3种贻贝的cox1序列差异分析

由表1可见，经测序拼接和人工校对，从新西兰绿唇贻贝、翡翠贻贝和紫贻贝3种贝类cox1片段中共获得39条序列，其中绿唇贻贝6条，翡翠贻贝18条，紫贻贝15条，校对后cox1的PCR产物可信长度紫贻贝为850 bp、绿唇贻贝和翡翠贻为730 bp左右；5′、3′端取齐进行核苷酸差异分析，共检测到20种单倍型，其中绿唇贻贝6个个体有5种单倍型，翡翠贻贝18个个体有6种单倍型，紫贻贝15个个体有9种单倍型，3种贝类种间无共享单倍型。绿唇贻贝、翡翠贻贝和紫贻贝cox1单倍型G+C含量明显低于A+T含量，平均分别为0.362、0.340、0.373。由图1可见，3种贻贝20种单倍型进行序列比对，共有665个比对位点，其中变异位点由248个，占37.3% （图1中仅列出180个变异位点）；绿唇贻贝与翡翠贻贝cox1变异位点有195个，占变异位点的29.3%，紫贻贝与绿唇贻贝和翡翠贻贝之间核苷酸变异位点分别为212和197个，分别占变异位点的31.9%、29.6%；绿唇贻贝、翡翠贻贝、紫贻贝3种贻贝种内个体间的核苷酸变异位点分别占变异位点的1.7%、1.5%、3.3%，与紫贻贝相比，绿唇贻贝与翡翠贻贝间核苷酸差异较小，共享变异位点相对较多，但cox1片段不同部位共享变异位点多少有不同。图1中下方左侧方框10个碱基中有7个共享变异位点，右侧方框中只有2个共享变异位点，有8个非共享变异位点分布在连续的25个碱基序列中，此区域可用于设计区分2种贻贝的PCR特异引物。

2.2 3种贻贝的遗传距离

基于cox1核苷酸序列的遗传距离显示，绿唇贻贝（LYB）、翡翠贻贝（FCYB）和紫贻贝（ZYB）的种内遗传距离分别为0.007、0.005和0.014，种间遗传距离为0.242（LYB-FCYB）、0.355（ZYB-FCYB）、0.393（ZYB-LYB）；绿唇贻贝与翡翠贻贝同属股贻贝属，其差异属于属内种间差异，因此两两遗传距离相对小，而绿唇贻贝、翡翠贻贝与紫贻贝遗传距离相对较大。

2.3 贻贝科贝类cox1核苷酸差异分析

从GenBank检索到贻贝科13个物种403条cox1片段序列（表2）用于分析种内遗传距离，结果表明，加里弗尼亚贻贝（Mytilus californianus） 440 bp的cox1片段核苷酸序列92个个体为M型、87个个体为F型，种内个体间遗传距离平均分别为0.004、0.010，M型与F型间的遗传距离为0.244；Geukensia demissa 57个序列间遗传距离0.000～0.026，平均为0.013；Limnoperna pulex 38个序列间遗传距离为0.000～0.053，平均为0.026；Mytilus edulis 26个序列间遗传距离，M型为0.009，F型为0.012，M型和F型之间的遗传距离为0.244；翡翠贻贝cox1（409 bp）片段20个序列的遗传距离为0.000～0.012，平均为0.005；基于33个 cox1片段（454 bp）的紫贻贝，其平均遗传距离为0.035，根据序列特征可将其序列分为3组即Mga1、Mga2和Mga3，其组内遗传距离分别为0.007、0.008、0.035，Mga1和Mga2间的遗传距离为0.019，Mga3和Mga1、Mga2间的遗传距离分别是0.062、0.063，Mga3存在明显的遗传分化，Mga1和Mga2间无分化；基于cox1片段（500 bp）Perna perna 20个序列的遗传距离为0.000～0.007，平均为0.004；油黑壳菜蛤（Mytilus trossulus） 12个cox1片段核苷酸序列差异较大，遗传距离为0.000～0.228，平均为0.162，可分成4组，即Mtr1～Mtr4（图2），4个组的组内遗传距离依次为0.018、0.005、0.014、0，Mtr1与Mtr2间的遗传距离为0.159，其余组间遗传距离为0.212～0.228，虽为同一个种，但差异达到种间差异水平，聚类时也明显分为4支，这可能是由于Mtr3在资料中标为M型，Mtr3与Mtr1、Mtr2间的分歧是由M、F型线粒体基因组DNA间的差异造成；样本DQ198225未标明是F型或M型，与其余11个序列的遗传距离为0.221～0.227，平均为0.220；绿唇贻贝cox1片段（467 bp）共14条，种内遗传距离为0.000～0.015，平均为0.007。

2.4 贻贝科系统演化关系分析

将从GenBank检索到的贻贝科403条序列与本试验39条序列一起进行贻贝科系统发育分析，因不同学者所用cox1片段序列在cox1全长中的位置和长短不同，经两头取齐，共获得长度为378 bp的单倍型38种，涵盖13个物种，根据单倍型构建NJ树。由图3可见，13个物种隶属于8个属，除毛贻贝属（Trichomya hirsute）与贻贝属种类交叉聚为1支外，其余各属均聚为单系支。本试验新西兰绿唇贻贝与资料中的绿唇贻贝（DQ917607，AF286188）聚为1支，另一来源的绿唇贻贝（DQ343592）与Perna perna（DQ343595）聚为1支，支持率为100%，这2支合聚为1支，支持率为51%；本试验的翡翠贻贝与资料中的翡翠贻贝（NC018362）聚为1支，支持率为100%；紫贻贝与加里福尼亚贻贝、毛贻贝聚为1支，贻贝属与毛贻贝遗传关系较近；连云港紫贻贝与资料中的紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）[FJ890849（F型）、DQ399833（M型）、NC006886（Mytilus spp.）]和Mytilus edulis（NC006161）聚为单系支，支持率100%，而紫贻贝Mytilus galloprovincialis （FJ890850）M型线粒体cox1与Mytilus edulis（AY823623）线粒体DNA聚为1支。由表3可见，8个属间的遗传距离为0.254～0.630，平均为0.486；贻贝属与Modiolula属间遗传距离最大，贻贝属与毛贻贝属间遗传距离最小。

3 结论与讨论

3.1 绿唇贻贝的分类地位

贻贝科股贻贝属目前认定的物种有3种，即新西兰绿唇贻贝、翡翠贻贝和P. perna （Linnaeus，1758），通过外部形态很难辩认这3种贻贝[5]。P. perna原产于亚洲西部和南部及南美洲大西洋沿岸，近年来已经入侵墨西哥湾沿海水域；翡翠贻贝自然产于亚洲沿海水域，从波斯湾到中国南方海域，现太平洋岛国和墨西哥湾、美国南部的太平洋沿海水域均有发现；

绿唇贻贝仅产于新西兰沿海水域。试验绿唇贻贝样本（LYB）来源于新西兰的奥克兰海域，与股贻贝种类聚为1支，但没有与资料中的绿唇贻贝（DQ343592）直接聚在一起，绿唇贻贝（DQ343592）与Perna perna （DQ343595）先聚为1支，而后与LYB聚在一起，这说明LYB与资料中提及的绿唇贻贝（DQ343592）亲缘关系相对远，资料中提及的绿唇贻贝样本同样采自新西兰，但具体采集地尚不清。基于cox1的遗传距离显示，Perna perna （DQ343595）与资料中绿唇贻贝（DQ343592）的遗传距离为0.003，而资料中的绿唇贻贝与LYB的遗传距离为0.167～0.180，接近Perna perna （DQ343595）和LYB间的距离，试验绿唇贻贝与资料中提及的绿唇贻贝间遗传差异大，达到种间差异水平。试验测定绿唇贻贝的cox1片段序列与大部分绿唇贻贝序列相似性很高，与绿唇贻贝（DQ343592）差异大，因此，绿唇贻贝（DQ343592）的分类地位有待进一步考证。Blair等认为，单独通过形态特征，很难辩认股贻贝属的3种贻贝[5]，而cox1序列分析有助于股贻贝属种类的识别。