β-兴奋剂的常用检测方法研究进展

2015-12-22伍晓红陈秋玲王琤韡

猪业科学 2015年10期

关键词：胶体金质谱法兴奋剂

聂婉，伍晓红，陈秋玲，周柳，王琤韡

（江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013）

β-兴奋剂的常用检测方法研究进展

聂婉，伍晓红，陈秋玲，周柳，王琤韡*

（江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013）

本文在简要介绍了β-兴奋剂检测中样品前处理技术的基础上，总结了近几年来国内外检测动物性食品中β-兴奋剂的常用分析方法，指出现行方法的优缺点，并提出了今后的发展趋势。

β-兴奋剂；常用检测方法；研究进展

β-兴奋剂作为一种促肾上腺受体激动剂，常被用于治疗哮喘类呼吸道疾病。随着美国首次将其投入饲料发现能提高瘦肉率后，被广泛地应用在畜牧业中，常见β-兴奋剂的结构式及类型如表1所示。在瘦肉精中毒事件的相继出现后，β-兴奋剂的不安全性逐渐显现，诸多国家立法严厉禁止β-兴奋剂在饲料和饮用水中的非法使用。本文简要概述近几年国内外对β-兴奋剂的样品的前处理技术和常见检测方法的研究进展。

表1 常见的β-兴奋剂

1 样品的前处理

分析样品的前处理过程，可细分为4大步骤（取样、提取、纯化和浓缩），必要情况下还需要衍生化的处理。选取样品时，可供选择的样品一般分为2大类：可食用组织（血液、内脏、肌肉等）和不可食用组织（尿液、毛发、视网膜等）。可食用组织中兽药残留量大，但处理相对繁琐，不可食用组织中则含量较低，采集相对容易。在样品前处理的后续步骤中，经典的液液萃取技术，由于易引入杂质、成本相对较高等缺点，使用频率相对较少；分子印迹技术、免疫亲和色谱技术和超临界萃取技术，虽具有高选择性和强特异性等优点，但耗时耗资的缺点需要进一步完善；新兴的样品前处理方法中，由固相萃取发展来的基体分散固相萃取法，步骤更精简、用量更少，趋向于标准化、一体化的分析模式。目前，微萃取技术与固相萃取技术凭借低成本、强选择性和易于实现自动化的优点，在β-兴奋剂检测中应用最为广泛。

2 常见检测方法研究进展

2．1 免疫分析技术

2.1.1 酶联免疫法（ELISA）

酶联免疫法基于竞争性酶反应原理，根据显示结果的颜色深度来分析待测物的含量，此方法常分为抗体的间接法、抗原的竞争法和抗原的双抗体夹心法。此方法作为较为成熟的检测方法，不需要昂贵的仪器设备，灵敏度高、特异性强且样品前处理相对简单，但因抗体理化性质不稳定，故具有较高的假阳性，且制备和纯化过程相对复杂，现常被用作现场的大批量初筛。胡霏等（2013）对借助方阵滴定ELISA法的抗体制备过程进行了优化，最后制成的酶标板反应时间仅需15分钟，极大提高了检测效率。王俊平等（2011）借助混合酸酐法建立的沙丁胺醇直接酶联免疫法，实际检测过程中沙丁胺醇与结构类似物几乎没有交叉反应，检测限也远低于国家残留。出于对交叉反应的考虑，在执法过程中如使用盐酸克伦特罗检测卡后显示为阳性，但在最后的气相色谱-质谱法确证又为阴性时，必须检测沙丁胺醇的存在。

2.1.2 胶体金免疫层析法（GICA）

胶体金免疫层析法是将胶体金作为示踪标志物的新型免疫标记技术，仅需肉眼观察2条检测限的颜色变化来判断检测结果，快速简便且特异性强，多用于现场的快速检测和大通量初筛。胶体金的质量对实验结果有很大影响，当胶体金pH接近且不低于蛋白质的等电点时，表面的吸附量最大，抗原抗体更易形成紧密的结合物。王森等（2012）优化金标抗体、羊抗鼠IgG和人工结合抗原制剂，成功研发出了瘦肉精的三合一多功能胶体金快速检测板，该板的检出限低，准确率高，适合瘦肉精的多残留检测。吴巧丽等（2012）借助沙丁胺醇-BSA 抗原和兔抗沙丁胺醇多克隆抗体-月炙体金标记物，对GICA法中的检测试剂的制备进行了优化，最低限浓度为2 ng/mL，检测时长缩短到3 min，且与盐酸克伦特罗的交叉反应率仅为2．67%。

2．2 色谱及色谱质谱联用法

2.2.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法作为半确证性的定量检测法，适用于强极性和热不稳定的β-兴奋剂及其代谢产物，假阳性率低、专属性与选择性强，分离度和检测精度高，且可获得有关β－兴奋剂分子结构方面的信息。但HPLC法的样品前处理过程繁琐，除不进行试样衍生化外，其他步骤如提取、纯化和定容都与气相色谱质谱法相同。在对畜产品的检测过程中，为了实现达到分析、过程的自动化，提升反应的灵敏度，HPLC法常与柱前提取、纯化、柱后荧光衍生化反应和质谱（MS）等系统连用。王鹤佳等（2014）依靠超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF MS）技术，分析和判断出盐酸克伦特罗在猪尿中的代谢产物，并由此推测盐酸克伦特罗在猪体内的主要代谢途径。孟文瑛等（2012）为测定盐酸克伦特罗研发了快捷精准的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱 ( SPEUPLC-MS/MS) 法，该方法最低检出限为0．05 µg /kg，并在0．25～50 µg /kg的范围内拥有良好的线性关系。

2.2.2 气相色谱-质谱法（GC-MS）

气象色谱-质谱法作为被国际上定为β-兴奋剂检测的最终确证方法，在灵敏度方面较HPLC更高，对于假阳性率而言较ELISA更低。在样品多残留的检测情况下，可对某一残留物进行定性、定量分析，且具有较高检测极限。但因样品前处理时间长、需要衍生化处理，操作技术要求高，仪器昂贵等因素，近几年对此研究的热点为提高该检测方法的速度和灵敏度。田苗（2010）在对猪组织中β-兴奋剂的检测时，借助阳离子交换柱的净化作用，将双三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷作为衍生剂，有效降低检出限至1 µg /kg，且具有良好的线性相关。Wang等（2006）建立了能够检测猪肝脏和猪尿中残留莱克多巴胺的免疫亲和色谱柱萃取IAC-GCMS法，检测限为0．5 ng/mL。由于需要复杂的衍生化，且处理试剂大多具有较强的毒性，现越来越倾向于使用液相色谱-质谱法作为定量分析的检测方法。

2.2.3 液相色谱-质谱法（LC-MS）

液相色谱-质谱法与气相色谱-质谱法相似，除了不需要衍生化外，试样提取和纯化等前处理步骤是统一的。实验室中可先对样品进行LC-MS测定，再对样品进行衍生化处理来进行GC-MS测定。该方法适用于大分子量、难挥发、高沸点、极性与极不稳定的化合物，目前主要用于检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等常见β－兴奋剂。在此方法的基础上，又有人将具有高分离能力的液相色谱和能有效提供分子结构信息的质谱联合起来，研发出了液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS/MS），不仅具有灵敏度高、选择性强等优势，还能在准确检测残留浓度之余获得丰富有效的化合物结构信息。Wu 等（2014）借助LC-MS方法，结合莱克多巴胺在猪体内的药代动力学研究，证实在停止给药24 d后，猪毛中仍有部分克伦特罗的残留。汪辉等（2015）根据β-兴奋剂的酸碱性，于酸性条件下对试样进行酶解和提取，最后通过LC-MS法分析的检测限为0．004 ng/mL 。