不同采收期广佛手指纹图谱研究

李金玉，贺文婷，王喜英 (广东轻工职业技术学院，广州广东 510300)

广佛手是芸香科柑橘属植物Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot．)Swingle 成熟果实，其性味辛、苦、酸、温，具有理气健胃、镇呕祛痰之功，治疗胸腹胀满、消化不良、咳嗽、痞满等症，为我国传统中药［1］。广佛手主产于广东化州、德庆武垄、高要悦城、云浮、郁南等地，栽培历史悠久，为广东地道药材“十大广药”。不同产地的广佛手指纹图谱已有研究［2－3］，但对于不同采收期的广佛手指纹图谱研究鲜有报道。笔者对不同采收期广佛手指纹图谱进行研究，揭示不同采收期广佛手成分含量的差异，以期为该药提供稳定、可重现的质量控制手段，同时确定广佛手药材的最佳采收期，从而实现广佛手药材的规范化种植。

1 材料与方法

1．1 仪器 Waters 2965 HPLC系统 (Waters Corporation，Milford，MA，USA)，包括四元泵、在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Empower3工作站。

1．2 试药 橙皮苷(成都植标化纯生物技术有限公司，批号120316，纯度≥98%)，5，7-二甲基氧基香豆素(天津希恩思生化科技有限公司，批号D-59430，纯度≥98%)，甲醇(色谱纯，德国默克公司，批号603－001－00－X)，冰乙酸(优级纯，天津市科密欧，批号20110513);其余所用试剂皆为分析纯。所用20批广佛手药材均采自广东省高要市回龙镇广佛手基地，由广州中医药大学中药学院林励教授鉴定为佛手Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot．)Swingl的果实。药材情况如表1所示。

1．3 方法

1．3．1 色谱条件。色谱柱Kromasil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，检测波长 283 nm，流速 1．0 ml/min，柱温 30 ℃;进样量20 μl。流动相为甲醇(A)/0．5%乙酸水(B)，梯度洗脱，线性梯度程序如表2所示。

表2 线性梯度洗脱程序

1．3．2 对照品溶液的制备。分别精密称定橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素对照品，用甲醇溶解稀释、定容，配制成0．20和0．50 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

1．3．3 供试品溶液的制备。各药材低温干燥后，粉碎，使全部通过80目筛。精密称取药材粉末2．50 g，置具塞三角瓶中，加入甲醇25 ml超声处理2次，每次30 min，滤过，合并滤液，低温真空回收溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶，取适量过0．22 μm微孔滤膜，得供试品溶液。

1．3．4 方法学考察。

1．3．4．1 精密度试验。同一广佛手供试品溶液连续进样5次，每次20 μl，记录色谱图，测得各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，说明仪器精密度良好。

1．3．4．2 重复性试验。取1 号样品 6 份，依据“1．3．3”方法制备，分别进样20 μl，记录HPLC色谱图，测得色谱图中各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，说明仪器重复性良好。

1．3．4．3 稳定性试验。精密吸取1号供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样 20 μl，测得各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2 结果与分析

2．1 广佛手指纹图谱建立 选取不同采收期的广佛手药材20 批，按“1．3．3”方法制备供试品溶液，分别进样20 μl，记录HPLC色谱图。将20批样本指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004 A版)进行数据处理，选择橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素2个色谱峰进行多点校正，色谱峰自动匹配后，以中位数法生成不同采收期广佛手指纹图谱及共有模式指纹图谱。从图1～2可以看出，同一采收期内的样本指纹图谱差异性较小，而2个不同采收期指纹图谱之间差异较为明显，说明不同生长期内广佛手中化学成分的种类及含量存在一定差异。经过对这20批样品的测试分析和多次研究比较，归纳确定广佛手的HPLC指纹图谱具有23个共有的基本特征峰。

2．2 广佛手药材共有峰的确定 采用相对保留时间标定共有指纹峰，20批不同采收期广佛手药材共有23个共有峰。其中16号和19号为橙皮苷和5，7－二甲氧基香豆素。以保留时间为60．989 min的16号色谱峰作为参照峰，计算20批样本共有峰相对保留时间、相对峰面积(表3～4)。

表3 20批样本共有峰相对保留时间

2．3 指纹图谱的相似度评价 采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004 A版)，对不同采收期广佛手样品进行相似度计算，通过与系统建立共有模式比较。由相似度计算结果(表5)可见，9月份采收的样本整体相似度高于7月份采收的样本;20批次样本的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均不低于0．94，考虑到生产中的各种变化因素，规定广佛手的指纹图谱与对照指纹图谱间的相似度应不低于0．85，反之为不合格。

表4 20批样品共有峰相对峰面积

续表4

表5 不同采收期广佛手相似度数据

3 讨论

3．1 色谱条件的选择 该试验考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0．5% 磷酸水溶液、甲醇－0．3%乙酸水溶液、甲醇－0．5%乙酸水溶液等多种流动相体系，以甲醇－0．5%乙酸水溶液系统洗脱可使色谱峰较好地分离，故选用该系统。该试验经DAD检测器分析，得到210～400 nm波段的三维扫描图，根据图谱选择各成分紫外吸收均较强的波长，在283 nm处，色谱图中各色谱峰信号丰富，所以选定283 nm为检测波长。

3．2 参照峰的选择 2010版药典主要通过控制橙皮苷的含量对佛手药材的质量进行控制，同时佛手中5，7－二甲氧基香豆素含量相对较高，所以广佛手指纹图谱共有峰以两者为参照峰。

3．3 不同采收期指纹图谱比较 7月份采收的样本为尚未成熟的广佛手果实，而9月份采收的样本为近成熟至成熟的果实。9月份采收的样本整体相似度高于7月份采收的样本，可能由于9月份样本已近成熟或成熟，果实内化学成分的种类及含量趋于稳定。同一采收期内的样品指纹图谱差异性较小，而2个不同采收期指纹图谱之间差异较为明显，说明不同生长期内广佛手中化学成分的种类及含量存在一定差异。

［1］国家药典委员会．中国药典(一部)［S］．北京:化学工业出版社，2010:167．

［2］林乐维，蒋林，郝大庆，等．不同产地广佛手药材HPLC指纹图谱的研究［J］．中成药，2009(12):1805 －1808．

［3］张瑞芳，高幼衡，崔红花，等．广佛手药材HPLC指纹图谱的研究［J］．中草药，2007(7):1075－1077．