气相色谱法测定养殖水体及水产品组织中的拟除虫菊酯

2015-12-22陈湘艺李小玲黄华伟黄向荣刘伶俐曾春芳

安徽农业科学 2015年14期

陈湘艺，李小玲，黄华伟* ，黄向荣，刘伶俐，曾春芳

(1．湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153;2．农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，湖南长沙 410153)

拟除虫菊酯是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯之后的一类广谱、高效、低毒、可生物降解的新型合成杀虫剂，其杀虫毒力较上述杀虫剂提高了10～100倍。由于该杀虫剂生物活性高且环境兼容性好，其销量已占世界农药市场的25%［1］。然而由于缺乏科学使用方法，使得其随农田排水、降雨淋洗而流入河流和池塘，不仅污染水体，对饮用水源造成潜在危险，而且还通过环境作用和食物链的富集，给生态环境、食品安全及人类健康都带来了危害。研究表明，拟除虫菊酯对哺乳动物的生殖、免疫和心脑血管等均有明显的毒副作用［2］，其对鱼类的毒性比哺乳动物和鸟类高1 000倍［3－4］，而且虾蟹类等甲壳类动物对拟除虫菊酯尤为敏感［5］。过量使用拟除虫菊酯易导致其在水产动物体内不断蓄积，引起中毒、畸变、繁殖衰退及死亡，其残留问题已引起欧盟、日本等多个国家和地区的高度重视，我国农业部第235号公告也规定了鱼肌肉中溴氰菊酯最高残留限量为30 μg/kg［6］。

近年来，多个地县市突发性大规模死鱼事件时有发生，给养殖户造成了巨大的经济损失，其多为拟除虫菊酯农药中毒引起，且甲氰菊酯的检出率高达80%。笔者就其中一起典型案例，运用气相色谱法对污染养殖池塘水体及水产动物组织中的拟除虫菊酯残留量进行了测定，旨在为水产养殖生产中类似事故的原因调查、样品采集和检测以及应急处置提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 供试样品。样品来自某养殖场池塘。

1．1．2 药剂与试剂。联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯6种菊酯类农药标准物质购自中国环境科学研究院，浓度均为100 μg/ml，规格为1 ml/支。正己烷(色谱纯)、环己烷(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、丙酮(色谱纯)、石油醚(分析纯，30～60℃沸程)、氯化钠(分析纯)、无水Na2SO4(分析纯)。

1．1．3 仪器。7890A气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，配有63Ni电子捕获检测器(ECD);Rotavapor R-3旋转蒸发仪(瑞士布奇公司);CR22GⅢ立式高速冷冻离心机(日本日立公司);XH-J旋涡混合器;BL-620S电子天平(日本岛津公司);N-EVAPTM111氮吹仪;固相萃取装置(安捷伦科技有限公司);1 g Supelco LC-Florisil净化小柱。

1．2 方法

1．2．1 样品诊断。选取中毒特征较明显的草鱼现场解剖，死亡的草鱼体色失去原有光泽，机体较僵硬，出现不同程度的肿胀，其眼睛突起红肿，鳃盖骨及鳍条均有不同程度充血(图1);解剖后观察，其鳃丝鲜红，并附有少量黏稠液体，细闻略有刺激性气味，鱼体腹腔充满积液，呈现一定程度腹水，内容物外翻，肝脏等内脏组织表面出现糜烂，伴有异味(图2)。经综合现场诊断及调研初步诊断为拟除虫菊酯农药中毒引起。

1．2．2 样品采集及保存。选取鱼类死亡严重的池塘，用采水器分别采集池塘表层水体(水面以下30 cm处)、底层水体(水底以上30 cm处)，装入5 L塑料壶中;同时采集中毒死亡体征明显的鱼样，分别取其肌肉、鳃及内脏组织，用匀浆机混匀后分别放入自封袋中待检。所有样品置于低温保温箱中保存，带回实验室5 d内完成分析检测工作。

1．2．3 样品前处理。

1．2．3．1 水样。用量筒取200 ml混匀水样置于500 ml分液漏斗中，加入10 g氯化钠摇匀，再加入20 ml正己烷振荡混匀3 min，同时不断放气，待静置分层后取上层有机相于100 ml锥形瓶中，重复加入20 ml正己烷提取2次，合并3次提取液于锥形瓶后过填充有无水Na2SO4的玻璃层析柱，收集滤液于100 ml茄形瓶中，于45℃水浴旋转浓缩至2 ml，然后转入10 ml塑料离心管，再用4 ml正己烷分2次冲洗茄形瓶，合并洗液于离心管后于45℃氮吹仪吹干，最后用1 ml正己烷定容上机。

1．2．3．2 水产品组织。草鱼肌肉、鳃及内脏组织样品的前处理方法参照高钰一等［7］的检测方法进行。称取5 g匀浆样品置于50 ml离心管中，加入环己烷－乙酸乙酯(1∶1，V/V)提取液15 ml，在旋涡混合仪上充分混匀1 min，超生提取10 min，6 000 r/min离心10 min，将上层有机相转移到100 ml茄形瓶中，重复加15 ml提取液提取1次，合并上层有机相于45℃水浴旋转蒸干。残余物用10 ml乙腈溶解，加入10 ml乙腈饱和的石油醚，充分混合，静置分层后弃去上层的石油醚，重复操作2次。下层的乙腈溶液于45℃水浴旋转蒸干，残余物用2 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)溶解，过SPE小柱净化。依次用5 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)、5 ml正己烷活化小柱，加入提取样液于小柱中，同时收集流出液于10 ml塑料离心管中，控制流速不超过2 ml/min，然后加入4 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)洗脱。将收集液在45℃水浴中用氮气吹干，用1 ml正己烷定容，供气相色谱仪分析。样品中拟除虫菊酯含量按公式C=(样品上机浓度×定容体积)/取样量计算，水体及鱼体组织中样品含量单位分别以μg/L和μg/kg表示。

1．2．4 色谱条件。色谱柱:HP-5(长度 30．0 m，膜厚 0．25 μm，内径320．00 μm);进样口温度:270 ℃;检测器温度:300℃;柱温程序:初温140℃保留1 min，以15℃/min升温至270℃后保留15 min;载气:99．999%高纯氮气;总流量:25 ml/min;隔垫吹扫流量:3 ml/min;尾吹流量:30 ml/min;进样方式:分流进样，分流比 10∶1;进样量:1．0 μl。

2 结果与分析

2．1 标准溶液气相色谱分析制备了0．005～0．200 μg/ml线性范围的6种菊酯类农药混合标准溶液，以出峰的保留时间定性，以峰面积总和定量。标准溶液气相色谱见图3，按出峰先后顺序依次为联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯。

2．2 样品检测结果初检时由于池塘表、底层水样中拟除虫菊酯农药含量较高，超出了线性范围，复检时对原水样均稀释20倍后进行检测。结果表明，污染池塘表层和底层水体均不同程度检出了甲氰菊酯，其含量分别为12．47和19．08 μg/L，水体底层含量明显高于水体表层(表1)。污染池塘水样检测的气相色谱见图4～图5。

此外，分别对草鱼肌肉、鳃及内脏组织进行检测。结果表明，除草鱼肌肉组织外，草鱼的鳃和内脏组织中均检出了甲氰菊酯，其含量分别为 3．27 和74．29 μg/kg，且草鱼内脏组织中甲氰菊酯含量较高，其含量为鳃组织的22．7倍，远远高于草鱼鳃组织，水样和草鱼组织中其他几种农药则均未检出(表1)。草鱼肌肉、鳃及内脏组织检测的气相色谱见图6～图8。

3 讨论

拟除虫菊酯杀虫剂作用方式一般为触杀和胃毒，由于其对鱼类等水生生物具有很高的毒性，故不能在水稻田、河流池塘及其周围地区使用该类杀虫剂。甲氰菊酯(俗称“灭扫利”)，其原药为棕黄色液体或固体，较难溶于水，其生产使用剂型多为20%乳油制剂，为淡黄色均相液体，易溶于水且密度比水大，在中性和酸性条件下稳定，遇碱易分解失效，其对水产养殖动物的危害多为急性神经性中毒。

研究表明，甲氰菊酯对多种水产动物均具有明显毒性［8－16］，其对草鱼［8］、尼罗罗非鱼［9］、黄鳝［10］、泥鳅［11］和鳗鲡［13］的 96 h 半致死浓度(LC50)分别为 2．50、5．90、6．55、38．02和6．55 μg/L，不同水产动物对甲氰菊酯的敏感程度也不相同，这与水产动物的呼吸方式和体表结构有关。谭娟等［9］研究了甲氰菊酯对尼罗罗非鱼急性毒性和外周血细胞的影响，结果表明甲氰菊酯浓度越大、用药时间越长，死亡率也越大，甲氰菊酯能造成红细胞形态发生明显变化;周立斌等［14］研究表明LC50与试验对象的种类、性别、大小以及水温、溶氧、pH等水质环境密切相关。对污染池塘水样的检测结果显示，池塘表、底层水体中均检出了甲氰菊酯，其含量分别为12．47和19．08 μg/L，远远超过了其对草鱼等大多数水产动物的安全浓度，水体底层含量明显高于水体表层，这可能与其在水体中的扩散和比重有关。

拟除虫菊酯是一类亲脂性很强的化合物，在水中能直接进入鱼鳃与鱼血液中［15］，不仅干扰鱼类的钠离子平衡，抑制鱼类鳃组织ATP酶活性，而且还对鱼类鳃组织造成病理损伤［16］。死亡草鱼鳃和内脏组织中均不同程度检出甲氰菊酯，其含量分别为 3．27 和 74．29 μg/kg，内脏组织中含量为鳃组织的22．7倍，可见甲氰菊酯中毒是造成养殖鱼类大范围死亡的主要原因之一，草鱼肌肉组织未检出拟除虫菊酯农药，可能与草鱼甲氰菊酯急性中毒死亡以及农药的富集残留时间有关。

因此，遇到类似事故应在第一时间向池塘水体中泼洒生石灰，促进药物的分解，同时加大池塘换水量，把经济损失降到最低;同时，对于污染的水产品，一定要就地掩埋或焚烧，避免误食或流入市场，对人类造成更大的危害。此外，在事故调查和鉴定方面现场采集水样时，最好分别采集不同水层的水样，尤其是底层水体;对于养殖鱼类，尽量采集所有种类的鱼类样品，分别取其肌肉、鳃以及内脏等不同部位的组织进行检测，所有样品低温保存后及时送交具有资质的检测机构进行检测，为维护自身合法权益提供有力依据。只有相关部门重视和加强该类药品的监管，形成联动机制，同时在农业生产中科学合理的使用该类农药，加强防范人为投毒以及采取必要的应急措施就能有效预防该类事故的发生。

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