白及叶片气孔观察方法的研究

陈 娜，王 婧 (亳州职业技术学院药学院，安徽亳州236800)

植物叶片气孔是与叶的功能有密切联系的一种结构，既是与外界进行气体交换的门户，又是水气蒸腾的通道，控制着蒸腾和光合2个基本生命过程［1］。气孔的开闭、分布以及气孔的发育过程对于研究植物对外界环境的适应过程至关重要［2］。气孔作为试管苗移栽后水分散失的主要门户，直接参与试管苗移栽后的水分代谢。因此，对于移栽困难的试管苗，气孔的观察是一项重要的研究内容。

白及 Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.系兰科植物白及属多年生草本植物，又名白芨，别名地螺丝、白鸡儿、刀口药、连及草等［3］。白及有着极高的药用价值，但自然状况下繁殖率低、繁殖慢、组培瓶苗移栽成活率低制约着白及产业的发展。植物气孔观察一般采用透明胶带粘取法、撕取法、印迹法及刮片法等［4－7］。不同的植物种类不同的发育时期由于叶片脆性和柔软度不同适用的研究方法有很大的差别。通过查阅相关文献，该试验采用刮片法、整体透明法对白及叶片气孔进行研究，最终得出白及叶片气孔的观察方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 采用移栽90 d之后的白及苗和其试管苗，取新鲜叶片(基部第一片叶)。

1.2 试验方法

1.2.1 刮片法。将叶片平放，选好取样部位，采用刀片将上表皮和叶肉组织刮去，选择较好的下表皮，剪下制片;在数码显微镜下，观察拍照。所用试验器材有锋利的双面刀、镊子等。

1.2.2 整体透明法。

1.2.2.1 固定。将白及生长环境下的叶片用剪刀剪成1 cm左右的小段，用乙醇乙酸混合液(6份乙醇+1份冰醋酸)固定24 h，以使叶片样品停止分裂并保持活体状态。

1.2.2.2 脱水。去掉乙醇乙酸混合液，先用70%乙醇室温浸泡30 min，再用无水乙醇浸泡2次，每次30 min。

1.2.2.3 透明。对固定和脱水后的白及叶片样品用三氯乙醛和甘油混合液(8 g水合三氯乙醛溶于1 ml甘油和2 ml蒸馏水)处理 4 h［8］。

1.2.3 观察、拍照。用荧光显微镜(Leica DM2500)对处理后的白及叶片样品进行观察并拍照。首先将处理过的叶片样品置于载玻片上，用手术刀将叶片切成约0.5 cm大小，之后在样品上滴一滴透明液并盖上盖玻片。

2 结果与分析

白及试管苗叶片柔软、含水量高，笔者无法采用刮片法观察到白及试管苗叶片的气孔，但利用刮片法观察到移栽苗的气孔，白及叶片表面皱缩，刮片时不易展平，难以将叶肉和表皮完全分离，气孔的观察效果不理想(图1)。

采用整体透明法固定处理后，肉眼可见白及叶片完全褪色，变成黄白色且变脆，经进一步脱水处理后，叶片颜色不变，但硬度变软;经透明及处理后，叶片变成浅黄色，但结构保持完整。经制片后，在显微镜下可观察到清晰的气孔。

白及叶片气孔的分布在上下表皮的分布是不均匀的，通过观察2种不同生境下白及苗的叶片，发现白及苗叶片下表皮气孔较多，上表皮气孔较少(图2)。试管苗叶片上表皮中有少量气孔存在，而移栽90 d的白及苗叶片的上表皮中很少能观察到气孔的存在。试管苗下表皮气孔分布稠密，多呈打开状态;而移栽90 d的苗下表皮气孔分布稀疏，呈闭合状。二者的气孔大小存在明显差异，试管苗的叶片气孔大于移栽后的叶片气孔;试管苗叶片气孔保卫细胞的内含物较多，而移栽苗叶片气孔保卫细胞内几乎无内含物(图3)。

3 讨论

在白及叶片发育的过程中，不同的生长环境对气孔的密度和发育状况有很大的影响，探讨白及移栽苗和试管苗气孔的分布特征，对提高试管苗移栽成活率尤为重要。通过该研究，确定了适宜白及叶片气孔观察的方法——整体透明法。叶片气孔的大小和分布能反映植物生理生态学特性。试管苗的气孔分布稠密且呈打开状态，与试管苗培养过程中的光照、水分和空气的相对湿度密切相关。光照促进糖、苹果酸的形成和K+、Cl－的积累［9］，利于气孔的开放。与移栽后的苗相比，试管苗叶片的含水量较高，气孔开放。试管中的空气湿度远高于自然环境下的空气湿度，试管苗气孔开放，而移栽后的苗叶片气孔数目减少、大多闭合且几乎无内含物，是其对环境适应的表现。不同生境下白及叶片气孔的特性不同，造成叶片不同程度的失水，可能是造成白及试管苗移栽成活率低的主要原因，因此在这方面还有待于进行更全面深入的研究。

［1］陆时万，徐祥生，沈敏健.植物学［M］.北京:高等教育出版社，1991:156－157.

［2］WANG H C，NGWENYAMA N，LIU Y D，et al.Stomatal development and patterning are regulated by envi-ronmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis［J］.The plant cell，2007，19(1):63 －73.

［3］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第18卷［M］.北京:科学出版社，1999:50.

［4］陈佰鸿，李新生，曹孜义.一种用透明胶带粘取叶片表皮观察气孔的方法［J］.植物生理学通讯，2004，40(2):215 －218.

［5］张秀芳，石东里，张兰.观察植物气孔结构的简易方法［J］.生物学通报，2002，37(6):42.

［6］林新春，俞志雄.木兰科植物的叶表皮特征及其分类学意义［J］.浙江林学院学报，2004，21(1):33 －39.

［7］邹琦.植物生理学实验指导［M］.北京:中国农业出版社，2008:23－26.

［8］段云峰，王幼宁，李霞.一种获得叶片表皮观察气孔的简易方法及其应用［J］.华北农学报，2008(S1):73－76.

［9］高华娟，陈信云.药用植物气孔之探析［J］.海峡药学，2011(7):55－56.