亳芍组织培养研究

李文峰，马宗新，马同富(.阜阳市农业科学院，安徽阜阳236065;2.阜阳师范学院，安徽阜阳23604)

亳芍即白芍，是《中国药典》中以“亳”字命名的中药材之一，亳州地产药材，指芍药科植物芍药或其变种毛果芍药栽培品的根。该植物为毛茛科多年生草本植物，花大而美丽，一般种植3～5年，9～10月采挖，去泥后放入开水中煮5～15 min，捞出后去皮晒干即可。加工后的芍药呈粉白色或白色，故又称“白芍”［1］。《药典》称亳芍。其性微寒，味微苦而酸。其根入药有平抑肝阳、敛阴养血、收汗缓中之功效，具有镇痛、镇静、解痉的作用，主治月经不调、经前腹痛、盗汗、头痛等。亳芍的产量约占全国的70%以上［2］。近年来由于反复种植该物种，产生众多的土壤病害，其产量受到了极大的威胁，因此亟待对其扩繁育苗进行研究［3－4］。笔者以种质快繁为目的，对亳州芍药组培、脱毒快繁关键技术进行研究，以期为其幼苗提供质量保障，并为农民获得安全放心苗提供技术依托。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试品种来自于安徽省亳州市中药材研究基地，以嫩芽为供试材料。

1.2 试验时间和地点 于2013年10月至2015年5月，在阜阳市农业科学院生物工程研发中心进行。

1.3 试验设计 诱导培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L，扩大培养基为 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.025 mg/L，生根培养基为 MS+IBA 0.025 ～0.05 mg/L。设计2种不同激素组合培养愈伤组织(表1)。所有培养基均附加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH为5.9～6.1，120℃灭菌30～35 min。

表1 基本培养基MS中激素配比情况 mg/L

1.4 外植体的消毒 采用的外植体为芍药的嫩芽，由于嫩芽与外界土壤直接接触，受菌类感染的机会很大，所以消毒过程十分重要。嫩芽先用清水清洗，剥去外层的鳞片，切除基部受伤部分，用适量洗洁精浸泡15 min，再用流水冲洗20 min;然后在超静工作台上先用75%乙醇消毒10 s，再用0.2%HgCl2消毒 10 min，最后用无菌水冲洗多次［5］。各处理均接种5瓶。

2 结果与分析

2.1 取材和放置时间不同对茎尖组培的影响 经过2年的对比试验结果表明，2月份取材的亳芍地下嫩芽在成活率、生长状况均优于10月取材的地下嫩芽(表2)。2月份取材的芍药地下嫩芽不仅污染率低于10月份取材的相同品种，且生长势强。原因在于2月份取材的地下嫩芽经过低温过程，休眠被低温打破，且营养储备时间长，芽体健壮。因此，亳芍地下嫩芽的取材应以2月份为宜，选取个体中等、尚未完全展开的地下嫩芽。

表2 取材时间对成活率的影响 %

材料放在基质中，随着放置时间的减小，地下嫩芽污染率从65.2%降低至28.1%;褐化率从60.3%升高至85.3%;成活率从34.8%升高到71.9%(表3)。原因是随着地下嫩芽放置时间的延长，其组织细胞失水，细胞活性降低，从而抵抗病菌的能力降低，消毒的效果也越差。所以，在相同材料的前提下，放置时间越短的植物材料成活率越高，但其褐化率也高。因此，地下嫩芽放置时间要综合考虑污染率和褐化率，对于不同放置时间的地下嫩芽，应选择不同的处理。放置到基质中的地下嫩芽比无处理的地下嫩芽的污染率低。材料无处理时，放置3 d后，成活率为0。由于放置到基质中的地下嫩芽鳞片之间贴合紧密，空隙少，杂菌进入几率小;其次，健壮地下嫩芽的生理活性高，生长势强，不易感染病菌。因此，亳州芍药组织培养应选取生长健壮、饱满的地下嫩芽。如果地下嫩芽轻微失水，应将芽放置于基质内，然后再进行组织培养;若地下嫩芽失水严重，就不能用它作为组培材料。

表3 放置时间对成活率的影响 %

2.2 芽和愈伤组织在不同时间段的生长状况 以饱满的地下嫩芽为接种材料，选用 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L为诱导培养基，观察30 d的生长情况。结果表明，前10 d芽的高度、直径和重量变化很小;第20天及第30天时，第30天重量是第20天的2倍，芽的高度和芽体直径增长较为明显，芽体生长较迅速(表4，图1)。因此，扩大培养时间应在30 d前后进行，此时间段芽体生长较旺盛，对扩大培养十分有利。

表4 培养基上芽的生长状况

挑取芽体基部的愈伤组织接种到扩大培养基MS+BA 0.5 mg/L+NAA0.025 mg/L 中，结果表明，30 d 后，直径从0.3 cm 增加到1.2 cm，重量从 0.1 g 增加到 1.7 g。其中第20～30天较前一阶段增加明显，增长幅度较大(表5)。说明愈伤组织在接种第20～30天生长很旺盛，扩大培养应选择在此时间段之后。

表5 接种30 d愈伤组织的变化

当愈伤组织放置时间超过40 d时，即使没有加入生根激素IAA，在其表面也会出现透明的根状物(图2)。

2.3 芍药茎尖愈伤组织诱导扩大培养 以芽基部愈伤组织为试验材料，选用MS为基本培养基，在不同浓度的BA、NAA中组合，分别在第10、20、30天观察记载生长情况(表6)。结果表明，14种培养基均能完成扩大培养，但生长状况在20 d左右时存在一定差异，随激素浓度的增加愈伤组织逐渐增多，到达一定程度时，有下降趋势;在只加BA、不加NAA的情形下，30 d后愈伤组织有明显的死亡现象。G11、G12培养基上愈伤组织增殖能力强，愈伤组织生长量大，适合作为诱导扩大培养的培养基。

表6 愈伤组织在不同激素配比时的生长情况

3 讨论

亳芍在组培苗培养过程中很容易受到污染，如培养基、超净工作台及容器等消毒过程不彻底、外植体带菌、工作人员操作不规范等［6］。但最主要的原因是芍药的地下嫩芽直接与土壤接触，且有多层鳞片包裹，容易滋生一些菌类［7］。主要是细菌和真菌，细菌在接种2 d左右即可被发现;真菌在接种7 d左右才出现症状。因此，芽的选择和消毒尤为重要，在实际操作中一定要认真对待。

芍药为多年生草本植物，次生代谢旺盛，地下嫩芽内含有较多的酚类化合物，组织培养过程中外植体极易褐化［8］，这些褐色物质在培养基中不断扩散，抑制其他酶的活性，毒害培养材料，严重影响组培苗的成活率、扩繁率［9－10］。该试验结果表明，地下嫩芽在基质中放置一段时间后能够有效地降低褐化率，但放置时间太久，会增加污染，这就形成矛盾。如何调节这一矛盾，还需要进一步研究。

针对如何把愈伤组织诱导成苗的问题，国内外专家学者进行大量研究，目前还没有一个行之有效的解决办法［11－12］。在试验中发现，当愈伤组织放置时间超过40 d时，即使没有加入生根激素IAA，其表面也会出现透明的根状物，具体原因有待进一步研究。

［1］马宗新，马同富，孟冬青.亳芍茎尖组织培养的研究［J］.中国野生植物资源，2010(6):63－66.

［2］魏志华，王新民，乔卿梅，等.亳芍药材适宜产区区划研究［J］.北方园艺，2011(11):170－172.

［3］吴红娟，于晓南.国内外芍药组织培养研究进展［J］.安徽农业科学，2010(2):617－619.

［4］张庆瑞，孙建洲，任凝辉，等.芍药组织培养技术研究［J］.河南农业科学，2006(4):88－90.

［5］董永义，宋旭，郭园.观赏芍药组织培养研究［J］.林业实用技术，2009(5):66.

［6］曲文静，李青，刘燕.芍药组织培养中地下芽污染的克服［J］.植物研究，2014(4):524－528.

［7］王吉凤，李青，包欣.芍药组织培养中污染现象的克服［J］.植物研究，2012(1):84－90.

［8］曲文静.芍药组织培养及褐化研究［D］.北京:北京林业大学，2014.

［9］王瑶.两种芍药愈伤组织的诱导及褐化抑制的研究［D］.哈尔滨:东北林业大学，2009.

［10］王瑶，岳桦.芍药属植物组织培养中褐化问题的研究进展［J］.黑龙江农业科学，2009(2):159－160.

［11］薛银芳，赵大球，周春华，等.芍药组织培养的研究进展［J］.北方园艺，2012(4):167－170.

［12］吴红娟.芍药品种地下芽诱导及愈伤组织培养研究［D］.北京:北京林业大学，2011.