c-met在新疆哈萨克族与汉族食管鳞癌组织及血清中的表达及意义

王兴名，郭莉，张志强，张园，程文霞，王洪江△

c-met在新疆哈萨克族与汉族食管鳞癌组织及血清中的表达及意义

王兴名1，郭莉2，张志强1，张园3，程文霞4，王洪江1△

目的探讨新疆哈萨克族（哈族）与汉族食管鳞癌患者组织及血清中c-met蛋白的表达及其与临床病理特征的关系。方法收集哈族和汉族食管鳞癌组织及其对应的癌旁食管组织各50例，采用免疫组织化学法检测组织中c-met蛋白的表达；取以上食管鳞癌患者血清标本，另择哈族和汉族健康体检者血清各40例，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清中c-met蛋白的含量。结果c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌组织中的阳性表达率分别高于其对应的癌旁组织，且c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌患者血清中的含量均分别高于其对应的健康体检者。食管鳞癌组织和血清中，c-met蛋白表达在不同肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期间差异有统计学意义，其中浸润至深肌层及突破浆膜（T3+T4）高于浸润黏膜及黏膜下层组（T1+T2），有淋巴结转移高于无淋巴结转移，TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期；c-met蛋白表达在不同民族、性别、年龄、组织分化程度间的差异均无统计学意义。结论cmet蛋白与哈族和汉族食管鳞癌的发生发展、浸润、转移及分期均有关，其在食管鳞癌组织和血清中的高表达，可能预示食管癌易浸润转移，并提示临床分期较晚。

食管肿瘤；癌，鳞状细胞；原癌基因蛋白质c-met；免疫组织化学；酶联免疫吸附测定

新疆哈萨克族（哈族）食管癌发病率明显高于汉族[1-2]，且以食管鳞状细胞癌（ESCC）为主。c-met蛋白是原癌基因c-met（prpto-oncogne c-met）表达产生的一种跨膜糖蛋白。多项研究显示，c-met蛋白的高表达与肿瘤的发生、发展及浸润性有关[3]，但该蛋白在哈族和汉族食管鳞癌患者民族间表达差异的研究并不多见，并且该蛋白在食管鳞癌患者血清中表达水平的研究也不多见。本研究采用免疫组织化学法检测新疆哈族和汉族食管鳞癌患者癌组织与对应癌旁组织c-met蛋白的表达程度，酶联免疫吸附（ELISA）法检测食管鳞癌患者及健康体检者血清中该蛋白表达量，并分析c-met蛋白与两民族食管鳞癌发生、发展、浸润及转移等临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年1月—2012年12月新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科手术切除标本100例，每例患者均取得远隔癌旁组织作为对照，所选病例术后病理均证实为食管鳞状细胞癌。其中汉族和哈族各50例，汉族年龄41～77岁，平均（57.00±3.06）岁；哈族年龄38～80岁，平均（58.00±2.17）岁；根据食管癌分期2010年(AJCC第七版）分期标准，术后分期Ⅰ期10例，ⅡA期17例，ⅡB期27例，ⅢA期26例，ⅢB期11例，ⅢC期9例；其中有、无淋巴结转移各50例。所选入组的患者术前均未行放疗及化疗。上述食管鳞癌患者血清标本由新疆肿瘤防治研究所标本库提供，另选择汉族和哈族健康体检者血清各40份作为健康对照，其中汉族和哈族男女性别比例均为1∶1，汉族年龄35～70岁，平均（55.38±4.49）岁，哈族年龄35～79岁，平均（57.81±5.86）岁。食管鳞癌患者与健康体检者的年龄（t=1.102）、性别（χ2= 1.147）差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 标本处理所有组织标本术中离体30 min内立即取材，取远隔5 cm以上癌旁食管组织作为对照，10%福尔马林固定，石蜡包埋，用于常规病理诊断及免疫组织化学染色。血清标本均为患者术前晨空腹静脉血，未加抗凝剂，30 min内送新疆肿瘤防治研究所标本库并立即处理，3 000 r/min离心10 min，分装后于-80℃冰箱冻存备用；健康体检者血清采集、保存方法同上。

1.3 主要试剂及仪器c-met兔抗人单克隆抗体、通用二抗、SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；Human c-met ELISA kit（EK0744）购自武汉博士德生物科技有限公司；美国Bio-rad酶标仪；德国Ditabis恒温振荡器；德国sigma高速离心机。

1.4 实验操作（1）免疫组织化学法。将标本蜡块制成4 μm厚连续石蜡切片。二甲苯脱蜡，水化；用3%H2O2乙醇溶液消除内源性过氧化物酶，高压法抗原修复，山羊血清进行封闭。切片采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（S-P法）染色。c-met抗体的工作浓度为1∶100。选用已知阳性食管癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，染色步骤严格按照产品说明书进行。（2）ELISA法。冻存标本在室温下缓慢平衡至室温；设置空白孔、标准品孔和待测标本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品；样本孔中加入待测样本，空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37℃恒温孵育。洗板，每孔加入底物，37℃避光孵育。滴加终止液并立即在450 nm波长处测定各孔的OD值。详细操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 结果判读（1）免疫组织化学结果。由2名病理专业医师在在完全不了解组织切片临床和病理资料情况下判读，并高倍镜下随机读取5个视野，每个视野观察细胞数不小于200个。c-met蛋白阳性表达定位于胞浆和（或）胞膜，阳性信号呈黄色、棕黄色、棕褐色颗粒样物质。根据阳性细胞比例（A）及染色强度（B）进行阳性程度的判断[4-5]。A判断标准为同一视野下阳性细胞数占同类细胞数的百分率，阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%以上为4分；B判读标准：淡棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以A×B结果作为c-met蛋白表达程度，乘积≤2为阴性（-），＞2分为阳性（+）。（2）ELISA结果。使用美国Bio-rad酶标仪，在450 nm波长处测定各孔的OD值，并连接计算机绘制标准曲线，求得待测样本中c-met蛋白含量值。

1.6 统计学方法应用SPSS 16.0软件进行统计分析，c-met蛋白在组织中阳性表达率之间的比较用χ2检验；c-met蛋白在血清中含量用表示，两独立样本间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-met蛋白在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达c-met蛋白在食管鳞癌组织及癌旁食管组织中的阳性表达定位于细胞膜或细胞浆，在癌组织中的染色呈弥漫分布，并可见少量淋巴细胞及血管内皮细胞，胞浆呈棕黄色；癌旁组织中染色主要位于基底细胞层，细胞排列整齐。见图1、2。c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌组织中的阳性表达率均分别高于其在癌旁组织中的阳性表达率（均P＜0.01），见表1。

Fig.1The positive expression of c-met in esophageal squamous cell carcinoma(×100)图1 c-met在食管鳞癌组织中的阳性表达（×100）

Fig.2The positive expression of c-met in the adjacent tissues of carcinoma(×100)图2 c-met在癌旁组织中的阳性表达（×100）

Tab.1Comparison of the expression of c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma and the adjacent tissues of carcinoma in Kazakh and Han people表1 c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌组织及癌旁组织中的阳性表达比较例（%）

2.2 食管鳞癌患者及健康体检者血清c-met蛋白水平比较哈族和汉族食管鳞癌患者血清c-met蛋白水平均分别高于其对应的健康体检者（均P＜0.01），见表2。

Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和汉族食管鳞癌患者及健康体检者血清c-met蛋白水平比较（μg/L，）

Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和汉族食管鳞癌患者及健康体检者血清c-met蛋白水平比较（μg/L，）

＊＊P＜0.01

组别食管鳞癌患者健康体检者t n 50 40哈族108.59±11.01 63.25±9.10 21.384＊＊汉族106.39±10.74 63.25±9.10 20.610＊＊

2.3 c-met蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系无论是在食管鳞癌组织中还是在血清中，c-met蛋白表达在不同肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期间差异有统计学意义，其中浸润至深肌层及突破浆膜（T3+T4）高于浸润黏膜及黏膜下层组（T1+T2），有淋巴结转移高于无淋巴结转移，TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期；c-met蛋白表达在不同民族、性别、年龄、组织分化程度间的差异均无统计学意义，见表3。

Tab.3The relationship between c-met protein and clinic pathological significance表3 c-met蛋白表达与临床病理特征的关系

3 讨论

c-met蛋白是原癌基因c-met转录翻译生成的一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，同时也是肝细胞生长因子（HGF）的受体[3]。该蛋白含有α、β两个亚基，两亚基通过二硫键连接形成异二聚体，α亚基位于胞外，β亚基跨膜，由于功能的不同分为3个结构域：细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域。其中细胞外结构域（β亚基胞外区和α亚基）是配体识别部位，可以特异性识别并结合配体（HGF）。而胞内结构域为β亚基C端（位于细胞内），其具有酪氨酸激酶的活性，是多种信号分子相互作用的共同结合部位[6]。当配体HGF与c-met受体结合后[7]，细胞外β亚基的相应位点被激活，信号传导入胞内，使酪氨酸激酶（PTK）激活，从而导致cmet受体自身酪氨酸残基（Tyr）磷酸化[8]，同时启动多种信号通路，如PI3K/Akt信号通路[9]、Ras和ERK/MAPK信号通路[10]等，从而促进细胞的分化、分裂，并能够调节多种器官组织的生长、发育，同时修复组织损伤。

本研究结果显示，c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌组织中的阳性表达率均分别高于其对应的癌旁组织，且c-met蛋白在哈族和汉族食管鳞癌患者血清中的水平均分别高于其对应的健康体检者。提示该蛋白的表达与两民族食管鳞癌发生有关，这与刘春涛等[11]的研究结果基本一致。胡亮等[12]采用纳米免疫磁珠方法检测c-met蛋白在胰腺癌患者外周血清中表达时，也发现外周血c-met蛋白表达阳性；周韵斓等[13]通过RT-PCR方法检测胃癌患者外周血细胞游离核酸标志物的研究中，发现胃癌患者外周血中c-met mRNA含量高于健康对照组。因此可以推测c-met蛋白的高表达与食管鳞癌发生存在密切关系，c-met蛋白在血清中的高表达可能提示两民族食管鳞癌高发生、高复发风险。

在肿瘤的发生、发展中，新生血管形成起至关重要的作用。c-met基因过度表达还可以促进新生血管形成和基底膜破坏，促进恶性肿瘤的侵袭和转移。而在HGF/c-met信号系统中，HGF不仅可以通过自分泌或旁分泌方法直接作用内皮细胞，促进肿瘤新生血管形成，还可以通过影响其他血管生长因子的水平，间接促进肿瘤的血管生成[7]。Grugan等[14]研究发现通过增加HGF/c-met信号系统中HGF血液中的含量，可以促进基底膜的破坏，加速恶性肿瘤的侵袭和转移。

另外本研究发现，c-met蛋白在组织和血清中的高表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。浸润至深肌层及突破浆膜组（T3+T4）该蛋白在组织和血清中的含量均高于浸润黏膜及黏膜下层组（T1+T2）；有淋巴结转移组该蛋白在组织和血清中的含量均高于无淋巴结转移组，提示该蛋白的高表达与食管鳞癌的侵袭性、转移性有关，其表达程度越高，提示侵袭性、转移性风险越大。并且随TNM分期越晚，该蛋白阳性表达程度及血清含量越高，提示该蛋白的高表达可能对食管鳞癌的TNM分期有一定影响。c-met蛋白在血清中的含量可能在一定程度上反映浸润深度、淋巴结转移及病期早晚，且c-met在血清中的检测较组织切片中检测更加方便，并能在术前早期筛检。

综上所述，c-met蛋白与哈族和汉族食管鳞癌的发生发展、浸润转移均有关；c-met蛋白在食管鳞癌组织和血清中的的高表达可能预示食管鳞癌易浸润转移，并提示临床分期较晚；该蛋白在组织及血清中的阳性表达可以作为食管鳞癌高转移性、侵袭性的分子标志物之一，而在血清中的检测更加方便，有望成为早期筛检指标之一。

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（2014-08-10收稿2014-09-26修回）

（本文编辑陈丽洁）

The expression and significance of serum c-met in esophageal squamous cell carcinoma of two different nationalities in Xinjiang

WANG Xingming1,GUO Li2,ZHANG Zhiqiang1,ZHANG Yuan3,CHENG Wenxia4,WANG Hongjiang1△
1 Thoracic Surgery,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830011,China;2 Medical Department,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University;3 Xinjiang Research Institution of Cancer Prevention;4 Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Division of Chemotherapy△

ObjectiveTo explore the relationship between serum expression of c-met protein and clinic pathological features in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)of Kazakh and Han people.MethodsA total of 50 samples of ESCC and its corresponding adjacent tissues of Kazak and Han patients were collected.The expression of c-met protein was detected by immunohistochemistry assay.The serum c-met protein was detected in 40 Kazak and Han ESCC samples and 40 Kazak and Han controls using ELISA method.ResultsThe positive expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those in its corresponding adjacent tissues respectively.And the serum expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those of healthy controls.There were significant differences in the different tumor invasion,lymph node metastasis and TNM stage of esophageal squamous cell carcinoma tissue and serum between groups,in which the infiltrated deep muscle and serous breakthrough(T3+T4)were higher than the infiltration of the mucosa and submucosa group(T1+T2),with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis,and TNM stage ofⅡB+Ⅲwas higher than that ofⅠ+ⅡA. There was no significant difference in the expression of c-met protein between ethnicity,gender,age and degree of differentiation.ConclusionThe c-met protein expression is related to the occurrence and development,the invasion,metastasis and TNM stage of ESCC in Kazak and Han nationalities.The high expression of c-met protein in tissue and serum may indicate the invasion and metastasis of esophageal cancer and prompt a late clinical stage.

esophageal neoplasm;carcinoma,squamous cell;proto-ontogeny proteins c-met;immunohistochemistry; enzyme-linked immunosorbent assay

R735.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.017

国家自然科学基金项目（81160271）

1新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科（邮编830011），2内三科；3新疆肿瘤防治研究所；4新疆医科大学第五附属医院放化疗科

王兴名（1987），男，硕士在读，主要从事食管癌外科治疗与基础研究

△通讯作者E-mail：whj71210@sina.com