PI3K-Akt、mito-KATP通道及mPTP在阿托伐他汀后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

2015-12-21刘春伟丛洪良于雪芳韩薇

天津医药 2015年1期

刘春伟，丛洪良△，于雪芳，韩薇

刘春伟1，丛洪良1△，于雪芳2，韩薇3

目的观察阿托伐他汀(ATV)后处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，探讨磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP通道)及线粒体膜通透性转换孔(mPTP)在其中的作用。方法将雄性Wistar大鼠随机分为对照组（I/R组）、阿托伐他汀后处理组（ATV组）、ATV复合PI3K抑制剂LY294002组（ATV+LY294002组）、LY294002组、ATV复合mito-KATP通道抑制剂5-羟葵酸（5-HD）组（ATV+5-HD组）、5-HD组、ATV复合mPTP开放剂苍术甙（ATR）组（ATV+ATR组）、ATR组，乙醇对照组。进行30 min缺血，120 min再灌注。观察各组心肌梗死范围，血流动力学指标，肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）含量，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)含量，心肌Akt和磷酸化Akt表达水平。结果ATV组心肌梗死范围、LDH、CK-MB较I/R组下降（P＜0.05），心肌NAD+含量较I/R组增加（P＜0.05）；ATV+LY294002组、ATV+5-HD组，ATV+ATR组心肌梗死范围、CK-MB、LDH，NAD+较I/R组差异无统计学意义。ATV组较I/R组血流动力学指标改善。Western blot显示ATV组、ATV+5-HD组和ATV+ATR组磷酸化Akt表达较I/R组增加，ATV+LY-294002组、LY-294002组、ATR组、5-HD组磷酸化Akt表达与I/R组相比无增加。结论阿托伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt、促进mito-KATP通道开放，抑制mPTP开放，产生心肌保护作用。

心肌再灌注损伤；1-磷脂酰肌醇3-激酶；KATP通道；腺苷三磷酸；线粒体；细胞膜通透性；阿托伐他汀后处理

近年来，他汀类药物在冠心病一级及二级预防的应用日益受到重视[1]。大量证据表明，他汀类药物除降脂外还有其他多种作用，包括抗炎、改善血管内皮功能、稳定斑块和抑制血管平滑肌细胞增生等[2]。对于急性心肌梗死的患者，早期开展再灌注治疗是挽救心肌的最佳手段，随着经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植术的大量开展，缺血再灌注损伤引起人们注意。研究显示，后处理具有良好的心肌保护作用，能够减轻缺血再灌注损伤。磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）通路和线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP通道)是后处理的重要信号通路[3]，线粒体膜通透性转换孔是后处理保护机制的终末效应器[4]，上述机制是否也参与了阿托伐他汀（ATV）后处理的心肌保护作用尚待研究。本研究旨在探讨PI3K-Akt、mito-KATP通道及线粒体膜通透性转换孔(mPTP)在ATV后处理减轻离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料健康雄性普通级Wistar大鼠234只，质量约240 g，普食喂养，购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心。MPA离体心脏灌流实验系统，上海奥尔科特生物科技有限公司。多导生理仪，河南华南医药电子有限公司。阿托伐他汀购自辉瑞制药有限公司。PI3K抑制剂LY294002（LY294002）、5-羟葵酸（5-HD）、苍术甙（ATR）均购于美国Sigma公司。磷酸化Akt（p-Akt，Ser 473）抗体、Akt抗体、蛋白Marker均购于CST公司（Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 离体大鼠心脏缺血再灌注模型建立腹腔注射肝素（500 U/kg）后，水合氯醛（5%，8 mL/kg）腹腔麻醉，迅速开胸取出心脏，置于4℃改良的Krebs-Henseleit（KH）液中洗净血液，迅速（2 min内）经主动脉插管悬挂于Langendorff灌流装置上，以改良KH液行非循环式恒温恒压主动脉逆行灌流（37℃，75 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）。改良KH液成分（mmol/L）：NaCl 118、NaHCO325、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、MgSO4·7H2O 1.2、葡萄糖11。改良KH液经95%O2+5% CO2的混合气体饱和，调节pH至7.4。在左心耳下缘与肺动脉圆锥左缘之间进针，用6-0丝线围绕前降支打一活结，线结内垫一粗丝线，通过拉紧和松开活结模拟心脏缺血和再灌注。剪开左心耳，将带有塑料薄膜球囊的测压管经二尖瓣插入左心室，由多导生理仪持续记录血流动力学参数。调节左心室内水囊的容量，使稳定灌流时左心室舒张末压（LVEDP)为5～10 mmHg。各组平衡灌注15 min后，缺血30 min，再灌注120 min。缺血及再灌注期间出现不可逆心室颤动者不纳入样本。

1.2.2 实验动物及分组按随机数字表法分为9组，每组26只。（1）对照组（I/R组）。（2）阿托伐他汀后处理组（ATV组），再灌注时加入25 μmol/L ATV（溶于0.1%乙醇）。（3）ATV+ LY294002组，再灌注时加入25 μmol/L ATV+15 μmol/L LY294002。（4）LY294002组，再灌注时加入15 μmol/L LY294002。（5）ATV+5-HD组，再灌注时加入25 μmol/L ATV+100 μmol/L 5-HD。（6）5-HD组，再灌注时加入100 μmol/L 5-HD。（7）ATV+ATR组，再灌注时加入25 μmol/L ATV+20 μmol/L ATR。（8）ATR组，再灌注时加入20 μmol/L ATR。（9）乙醇对照组，灌流液中加入0.1%乙醇，余同I/R组。

1.2.3 观察指标（1）血流动力学指标（n=26）。分别于稳定灌流15 min，结扎前降支30 min，再灌注5 min、20 min、60 min、120 min测定左室发展压（LVDP）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压力最大上升速率（dp/dtmax），LVDP=LVSP-LVEDP。（2）心肌梗死范围（n=14）。再灌注末，再次结扎前降支，主动脉内逆行注入伊文思蓝。取下心脏，冰冻后切片，切片置入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸缓冲液（pH 7.4）中，37℃水浴10 min，然后置于4%中性甲醛中固定12 h。将左心室切片，称质量，并拍照，用Imagepro-Plus图像处理软件分析梗死区、缺血区及左心室面积。参照文献[5]方法计算心肌缺血范围和心肌梗死范围，心肌缺血范围=缺血区面积/左心室面积，心肌梗死范围=梗死区面积/缺血区面积。（3）肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）含量（n=14）。参照文献[6]方法收集再灌注120 min内总灌流液，自动生化仪检测CK-MB和LDH浓度。（4）心肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量（n=6）。灌注末，剪取50 mg左心室缺血区心肌组织，加入0.6 mol/L高氯酸5 mL冰上研磨匀浆，离心后取上清，加入1 mol/L K2HPO40.5 mL，用3 mol/L KOH中和至pH值7.4，沉淀后取上清，加入乙醇脱氢酶20 μL，用分光光度计测定340 nm下的光密度值，以光密度值反映NAD+含量。沉淀物溶于0.1 mol/L NaOH，测定其蛋白浓度。

1.2.4 Western blot检测Akt和磷酸化Akt取左室缺血区心肌组织放入-80℃冰箱中冷冻，剪碎，加入组织裂解液，冰上匀浆。4℃以12 000 r/min离心15 min提取总蛋白，测定蛋白浓度。上样总蛋白量为40 μg，以等体积上样缓冲液稀释，煮沸15 min，室温下SDS-PAGE电泳，4℃过夜电转到PVDF膜上，常规洗膜封闭，孵育相应一抗(非磷酸化抗体1∶1 000稀释，磷酸化抗体1∶500稀释，actin抗体1∶3 000稀释)和二抗(1∶1 000稀释)，随后化学发光、X线胶片曝光、显影，定影。每张膜分别检测Akt、磷酸化Akt和actin的含量。以actin含量作为内参照，使用Quantity One software 4.6.2全自动图像分析系统对Western blot图片进行图像分析。

1.3 统计学方法应用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。计量资料进行单样本KS检验，正态分布者以均数±标准差表示，组间比较用方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学各组稳定15 min和结扎30 min时血流动力学指标差异无统计学意义，再灌注开始后，I/R组LVEDP较结扎前升高，LVDP和dp/dtmax较结扎前降低。ATV组再灌注开始后各时间段LVEDP较I/R组降低，LVDP和dp/dtmax较I/R组升高（P＜0.05）。其余各组血流动力学变化与I/R组相似，见表1～3。

Tab.1Comparison of LVEDP between nine groups表1 各组LVEDP比较（n=26，mmHg，）

＊＊P＜0.05；a与I/R组比较P＜0.05，表2～4同

组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F稳定15 min 6.92±1.57 6.67±1.96 6.97±1.86 7.32±1.98 7.21±1.74 7.64±1.94 7.98±1.97 6.81±1.91 7.13±1.87 1.547结扎30 min 12.00±2.12 10.86±2.25 11.08±2.36 11.17±2.34 10.83±1.86 11.00±2.05 11.33±1.58 11.35±2.57 11.90±1.44 1.830再灌注5 min 19.83±2.57 16.17±1.97a18.75±2.01 18.75±2.78 19.56±2.35 18.83±2.34 20.00±2.01 19.29±2.12 18.75±2.45 18.535＊＊再灌注20 min 16.56±2.12 12.50±2.34a15.12±3.14 15.25±3.25 15.83±2.45 16.57±3.04 16.42±2.35 15.43±3.22 14.98±2.53 21.610＊＊再灌注60 min 11.42±1.94 8.25±1.87a11.37±2.65 11.29±2.34 10.39±2.01 12.26±2.96 10.45±2.64 11.32±2.60 10.94±2.21 5.738＊＊再灌注120 min 10.25±1.87 8.33±2.23a11.20±2.34 11.28±2.10 9.68±2.79 10.35±2.63 10.26±2.03 9.68±2.11 10.22±2.15 3.431＊＊

Tab.2Comparison of LVDP between nine groups表2 各组LVDP比较（n=26，mmHg，）

稳定15 min 108.67±10.53 108.63±10.12 110.20±11.68 111.20±13.09 107.64±11.77 111.09±14.52 107.65±11.60 108.56±11.75 104.32±10.58 1.424组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F结扎30 min 60.34±4.52 58.91±3.96 62.30±4.96 61.59±4.51 57.23±4.31 62.33±5.13 59.32±4.01 58.36±4.56 55.90±4.75 1.743再灌注5 min 69.75±4.92 81.25±6.28a 70.12±5.22 72.26±5.32 66.35±4.96 70.61±4.61 68.64±5.33 72.12±5.14 68.35±5.12 12.649＊＊组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F再灌注20 min 82.08±6.93 91.25±7.82a 80.54±6.85 81.29±6.95 79.62±6.69 80.23±6.58 79.84±5.99 79.65±6.98 78.42±6.59 14.321＊＊再灌注60 min 76.17±4.00 85.42±5.82a 77.31±4.00 74.69±4.32 71.20±4.03 72.51±3.95 73.64±4.03 74.68±4.41 71.22±3.87 8.947＊＊再灌注120 min 74.32±4.57 82.30±5.32a 73.26±4.37 70.12±4.57 69.34±4.22 68.32±4.62 68.56±4.63 66.90±4.37 68.51±4.50 4.280＊＊

Tab.3Comparison of dp/dtmaxbetween nine groups表3 各组dp/dtmax比较（n=26，mmHg/s，）

稳定15 min 2 945±186 3 000±205 2 850±195 2 894±200 2 860±203 3 050±210 2 790±186 2 861±184 2 965±213 1.315组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F结扎30 min 1 745±143 1 659±150 1 690±120 1 753±147 1 800±135 1 740±138 1 700±130 1 772±149 1 756±167 1.783再灌注5 min 1 906±153 2 254±180a1 790±163 1 856±168 1 930±154 1 856±167 1 900±162 1 896±168 1 963±159 24.074＊＊组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F再灌注20 min 2 096±167 2 564±179a1 985±172 2 053±160 2 120±149 2 064±164 2 100±158 1 968±150 2 210±163 27.931＊＊再灌注60 min 1 965±160 2 498±192a1 900±158 1 950±144 1 964±142 1 859±157 1 927±143 1 796±135 2 018±149 13.582＊＊再灌注120 min 1 900±159 2 318±168a1 857±146 1 869±140 1 856±142 1 750±138 1 846±152 1 745±156 1 828±161 9.217＊＊

2.2 LDH和CK-MB含量ATV组LDH和CKMB低于I/R组（P＜0.05）。应用LY294002、5-HD或ATR，阿托伐他汀后处理减少LDH和CK-MB释放的作用均能被消除。与I/R组比较，单独应用LY294002、5-HD或ATR，LDH和CK-MB释放差异无统计学意义，见表4。

Tab.4Comparison of LDH,CK-MB and NAD+myocardial infarction size,and the expression levels of Akt and p-Akt between nine groups表4 各组LDH、CK-MB、NAD+含量、心肌梗死范围、Akt和p-Akt表达水平比较

组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F LDH（U/mg，n=14）327±14 201±15a 314±14 339±13 330±16 322±17 318±21 314±19 335±17 91.493** CK-MB（U/mg，n=14）143±13 96±8a 131±11 143±10 136±11 142±12 133±11 132±13 139±9 24.778** NAD+含量（nmol/g，n=6）75±7 98±11a 70±6 78±8 75±6 81±9 78±7 72±6 77±7 6.850**组别I/R组ATV组ATV+LY294002组LY294002组ATV+5-HD组5-HD组ATV+ATR组ATR组乙醇组F心肌梗死范围(%，n=14) 39.50±3.84 24.68±2.86a 37.45±3.41 42.14±3.78 38.86±3.32 41.57±3.03 39.21±2.91 37.75±3.30 41.90±3.01 36.734** Akt (AU，n=6) 47.3±4.8 51.6±4.0 54.0±5.2 49.7±5.3 52.4±4.3 51.8±4.1 49.6±4.5 50.1±4.2 -3.572 p-Akt (AU，n=6) 43.5±4.0 84.8±6.2a 38.8±4.9 37.3±5.4 79.2±6.3a 39.8±4.7 81.7±4.2a 45.0±4.3 -106.630**

2.3 心肌NAD+含量ATV组NAD+含量高于I/R组（P＜0.05）。阿托伐他汀后处理的同时应用LY294002、5-HD或ATR，阿托伐他汀后处理减少NAD+释放的作用均能被消除。与I/R组比较，单独应用LY294002、5-HD或ATR，NAD+释放差异无统计学意义，见表4。

2.4 心肌梗死范围比较ATV组心肌梗死范围较I/R组减小（P＜0.05）。LY294002、5-HD和ATR均能部分消除阿托伐他汀后处理的心肌保护作用，单独应用LY294002、5-HD或ATR与I/R组比较心肌梗死范围差异无统计学意义，见表4。

2.5 心肌Akt和磷酸化Akt蛋白表达水平各组心肌Akt表达差异无统计学意义。再灌注120 min后，ATV组、ATV+5-HD组和ATV+ATR组大鼠左室心肌p-Akt（Ser 473）的表达高于I/R组（P＜0.05）。LY-294002能够抑制阿托伐他汀后处理引起的心肌p-Akt表达增加。ATV组、ATV+5-HD组和ATV+ATR组3组间心肌p-Akt的表达水平差异无统计学意义，见表4、图1。

Fig.1The expressions of Akt和p-Akt(Ser 473)in ischemic/reperfused rat hearts图1 各组大鼠离体心脏再灌注120 min后Akt和p-Akt（Ser 473）表达水平

3 讨论

他汀类药物后处理是减少心肌缺血再灌注损伤的有效方法，Kocsis等[7]用50 μmol/L洛伐他汀后处理能有效地减少心肌缺血再灌注损伤。本研究采用类似的方法，显示25 μmol/L阿托伐他汀后处理使心肌梗死范围、LDH和CK-MB均下降。同时，ATV改善再灌注后血流动力学指标，提示阿托伐他汀后处理具有心肌保护作用。

mPTP位于线粒体内膜，是电压和钙离子依赖性通道[8]。腺苷酸转移酶和电压依赖性阴离子通道(VDAC)是mPTP重要组成成分[9]。再灌注早期数分钟内，受细胞内钙超载，氧化应激等刺激，mPTP开放，使线粒体内膜对小分子物质通透性迅速提高，导致线粒体内膜电位破坏，氧化磷酸化解偶联，线粒体内细胞色素C释放，诱发细胞坏死和凋亡[10]。本研究中发现阿托伐他汀后处理可以抑制缺血再灌注时mPTP开放，而mPTP开放剂ATR可以拮抗阿托伐他汀后处理的心肌保护作用，提示阿托伐他汀后处理可能通过抑制mPTP开放产生心肌保护作用。

PI3K-Akt通路是后处理保护作用的重要调控因子[11]。本研究结果表明，PI3K-Akt抑制剂能够拮抗阿托伐他汀后处理的心肌保护作用，同时ATV组磷酸化Akt水平较对照组增高，提示阿托伐他汀后处理通过PI3K-Akt通路发挥心肌保护作用。PI3K-Akt可通过磷酸化下游靶点糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，调节诸如糖原代谢、基因表达，细胞存活等众多细胞活动[12]。本研究给予PI3K-Akt抑制剂后，mPTP开放数量增多，提示PI3K-Akt可抑制mPTP开放。介导信息从胞浆内传导至线粒体内的具体途径目前尚未明悉。Das等[13]研究发现，磷酸化的GSK-3β可以减慢线粒体外膜腺苷酸转移，调节VDAC磷酸化水平，最终抑制mPTP开放。

本研究结果表明mito-KATP通道参与了阿托伐他汀后处理的心肌保护作用。mito-KATP通道位于线粒体内膜，其开放和关闭受ATP/ADP、GTP/GDP和蛋白激酶C等调控[14]。Jin等[15]研究表明mito-KATP通道抑制剂5-HD能够使缺血后处理的心肌保护作用消失，阻断mito-KATP通道能够拮抗法舒地尔[16]和人胰高血糖素样肽2[17]的心肌保护作用，以上结果均支持本研究。

Zhou等[18]研究表明阿托伐他汀预处理能上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS），开放mito-KATP通道，减少心肌梗死面积。目前，阿托伐他汀后处理开放mito-KATP通道的机制尚不明确，是否通过iNOS途径仍有待进一步研究。本研究给予mito-KATP通道阻滞剂后，mPTP开放数量增多，提示mito-KATP通道开放可抑制mPTP开放，Penna等[19]研究表明，mito-KATP通道开放后产生少量活性氧自由基（ROS），抑制mPTP的开放，产生心肌保护作用。

阿托伐他汀后处理可能通过激活PI3K-Akt通路，促进mito-KATP通道开放，最终抑制mPTP开放，产生心肌保护作用。其中，mPTP是终末效应器，而PI3K-Akt通路及mito-KATP通道是其上游调节途径。

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（2014-01-06收稿2014-08-27修回）

（本文编辑魏杰）

Cardioprotective effects of atorvastatin postconditioning on ischemia-reperfusion injury in isolated rat heart:the role of PI3K-Akt,mito-KATPchannel and mPTP

LIU Chunwei1,CONG Hongliang1△,YU Xuefang2,HAN Wei3

1 Department of Cardiology,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300222,China;2 Department of Cardiology,General Hospital of Tianjin Medical University;3 Department of Cardiac Surgery,Anzhen Hospital△Corresponding AuthorE-mail：hongliangcong@163.com

ObjectiveTo observe the postconditioning cardioprotective effects of atorvastatin(ATV)on ischemia-reperfusion injury in isolated rat heart,and the role of phosphatidylinositol-3-kinase,protein kinase B(PI3K-Akt),mitochondrial ATP-sensitive potassium(mito-KATPchannel)and mitochondrial permeability transition pore(mPTP)thereof.MethodsHealthy male Wistar rats were randomly divided into 9 groups:ischemia reperfusion(I/R)control group,atorvastatin postconditioning(ATV)group,ATV plus PI3K inhibitor LY294002(ATV+LY294002)group,LY294002 group,ATV plus mito-KATPchannel inhibitor 5-hydroxydecanoate(ATV+5-HD)group,5-HD group,ATV plus mPTP inhibitor ATR(ATV+ ATR)group,ATR group and ethanol group.Model rats were given 30-min ischemia followed by 120-min reperfusion.The myocardial infarction size,hemodynamic parameters,creatine kinase isoenzyme(CK-MB),lactate dehydrogenase(LDH),nicotinamide adenine dinucleotide(NAD+)and the expression of myocardial protein kinase B(Akt)and myocardial phospho-protein kinase B(p-Akt)were evaluated.ResultsCompared with the control group,atorvastatin reduced the myocardial infarction size,CK-MB and LDH（P＜0.05),increased NAD+（P＜0.05).There were no significant differences in the myocardial infarction size,CK-MB,LDH and NAD+between ATV+LY294002 group,ATV+5-HD group and ATV+ATR group.The hemodynamic parameters were improved in ATV group compared with those in control group.Western blot analysis con-firmed the significant phosphorylation of Akt in ATV group,ATV+5-HD group and ATV+ATR group compared with those of control group.There were no significant differences in the phosphorylation of Akt between ATV+LY294002 group, LY294002 group,ATR group and 5-HD group.ConclusionAtorvastatin postconditioning could attenuate the ischemia-reperfusion injury through activating the PI3K-Akt,promoting mito-KATPchannel opening and inhibiting mPTP opening.

myocardial reperfusion injury;1-phosphatidylinositol 3-kinase;KATP channels;adenosine triphosphate; mitochondria;cell membrane permeability;atorvastatin postconditioning

R654.2

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.012

1天津市胸科医院心内科（邮编300222）；2天津医科大学总医院心内科；3首都医科大学附属北京安贞医院心外科

刘春伟（1986），男，硕士研究生，主要从事心肌缺血再灌注损伤研究

△通讯作者E-mail：hongliangcong@163.com