牛蒡根水提物对高血压大鼠血管内皮损伤的保护作用

赵娜，马维红△，苏赢，翟振丽，覃晓莹

牛蒡根水提物对高血压大鼠血管内皮损伤的保护作用

赵娜1，马维红1△，苏赢2，翟振丽3，覃晓莹4

目的探讨牛蒡根水提物对高血压大鼠血管内皮损伤的保护作用及机制。方法用N-硝基-L-精氨酸（L-NNA)复制高血压大鼠模型,随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（卡托普利15 mg/kg）、牛蒡根水提物低剂量组（0.5 g/kg）、牛蒡根水提物中剂量组（1.0 g/kg）及牛蒡根水提物高剂量组（2.0 g/kg），连续灌胃6周，测定大鼠用药后1、4、7、10、13、16、19、22、29、36、42 d的收缩压；6周后，检测大鼠血清C-反应蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）水平，取大鼠胸主动脉，测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）水平。结果（1）牛蒡根水提物组的大鼠尾动脉收缩压低于模型对照组（P＜0.05）。（2）牛蒡根水提物可显著改善血管的内皮损伤程度，抑制内膜内皮细胞脱落及血细胞黏附，并抑制中膜平滑肌细胞、胶原纤维增殖等。（3）牛蒡根水提物组的血清IL-6、CRP炎症因子及血管内皮ICAM-1表达水平低于模型对照组(P＜0.05）。结论牛蒡根水提物对高血压大鼠血管内皮损伤具有明显改善作用，其机制可能与其抑制炎症因子IL-6、CRP及ICAM-1的表达，改善高血压大鼠血管内皮慢性炎症反应有关。

牛蒡；高血压；内皮,血管；C反应蛋白质；白细胞介素6；胞间黏附分子1

高血压病是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑卒中等心脑血管疾病的发病原因之一，其发病机制复杂。近些年研究表明血管内皮细胞损伤既为高血压的病理结果，又是其致病因素，是“内皮—高血压—心血管事件”链的重要组分[1]，因此，改善血管内皮功能为治疗高血压病的重要靶点。牛蒡是菊科牛蒡属2年生草本植物，也称东洋参，牛蒡根为牛蒡的肉质直根，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降低血糖及血尿酸、扩管等作用[2-6]。但国内外少见有关牛蒡根水提取物在高血压血管内皮损伤机制中的研究报道。本研究旨在观察牛蒡根水提物对高血压大鼠模型的血压、血管内皮形态变化及炎症因子表达水平的影响，探讨其对高血压大鼠血管内皮损伤的保护作用及机制，从而为牛蒡根水提物的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂SPF级雌性Wistar大鼠60只，12周龄，270～300 g，购自桂林医学院实验动物中心，许可证编号：SCXK（桂）2013-0001。牛蒡根水提物（西安昌岳生物科技有限公司，批号：20140106，规格10∶1）；N-硝基-L-精氨酸（LNNA，北京华迈科生物技术有限责任公司，批号：N009711）；卡托普利（大连美仑生物技术有限公司，批号：MB1527）。大鼠C-反应蛋白（CRP）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；大鼠细胞白介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 实验仪器ALC-HTP动物恒温系统及ALC-NIBP无创血压测量分析系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；生化培养箱（广东省医疗器械厂）；光栅型连续波长酶标仪（美国伯乐）；微量台式高速冷冻离心机（Thermo公司）；光学显微照相系统及OLYMPUS BX60型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组将大鼠按随机数字表法随机分为6组，每组10只：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、牛蒡根水提物低剂量组、牛蒡根水提物中剂量组及牛蒡根水提物高剂量组，实验前先适应性喂养1周。

1.3.2 高血压大鼠模型的建立除正常对照组外，余5组参考文献[7-8]，将L-NNA按照15 mg/(kg·d)剂量分2次腹腔注射以制备高血压大鼠模型，在大鼠清醒、安静、恒温（37℃左右）状态下，于每日17:00用ALC-NIBP无创血压测量分析系统监测尾动脉血压，连续测3次，每次间隔60 s，取平均值作为结果。

1.3.3 给药方法每天上午9:00用大号灌胃针按1 mL/100 g体质量灌胃给药，牛蒡根水提物低、中、高剂量组分别给予0.5、1.0、2.0 g/(kg·d)牛蒡根水提物，阳性对照组给予卡托普利15 mg/(kg·d)，余2组给予同量生理盐水。连续给药6周，每周称体质量1次，并调整给药量。

1.3.4 收缩压测定在恒温环境中，于大鼠安静、清醒状态下监测用药后1、4、7、10、13、16、19、22、29、36、42 d的收缩压。

1.3.5 CRP、IL-6检测禁食12 h后，给予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，于腹主动脉取血4 mL，静置、分离血清，ELISA法测CRP、IL-6，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6 胸主动脉组织形态学观察取胸主动脉血管置入4%中性多聚甲醛中固定、脱水透明及石蜡包埋切片，HE染色后于×200高倍镜下观察组织形态学变化并摄片。

1.3.7 ICAM-1检测将胸主动脉切片脱蜡至水后，用柠檬酸抗原修复液（pH=6）进行高压热修复，3%过氧化氢室温孵育10 min，再依次按1∶80滴加一抗，孵育60 min，滴加二抗，孵育10～15 min,二氨基联苯胺（DAB）显色3～10 min，最后水清洗、苏木精复染、乙醇脱水、干燥、封片。以光镜下观察到内皮细胞胞膜或胞浆内棕褐（黄）色颗粒样物质为阳性表达，从每张切片中任意挑取5个不重叠视野，输入到BI2000图像分析系统中，测出阳性颗粒的平均光密度值（OD）来代表该标本的蛋白质表达水平。

2 结果

2.1 牛蒡根水提物对高血压大鼠收缩压的影响在用药前后不同时间收缩压差异有统计学意义（F时间=5 796.962，P＜0.001），各用药组均是如此，用药后收缩压逐渐降低，到36 d时基本平稳。各组之间收缩压差异有统计学意义（F组间=4 683.644，P＜0.001），给药前，各用药组、模型对照组的收缩压高于正常对照组（P＜0.05），各用药组与模型对照组之间差异无统计学意义；用药后1～42 d，各用药组收缩压均低于模型对照组（均P＜0.05），用药36～42 d，牛蒡根水提物高剂量组、阳性对照组的收缩压与正常对照组无明显差异（P＞0.05)。组间和处理时间之间存在交互效应（F交互=624.990，P＜0.001），见表1。

2.2 牛蒡根水提物对高血压大鼠血清炎症因子IL-6、CRP水平的影响模型对照组大鼠血清炎症因子IL-6、CRP表达水平高于正常对照组(P＜0.05)，连续用药6周后，牛蒡根水提物高、中、低剂量组大鼠IL-6、CRP表达水平均低于模型对照组(P＜0.05)，见表2。

2.3 牛蒡根水提物对高血压大鼠胸主动脉形态的影响正常对照组:血管壁无增厚，各层膜结构清晰、界限清楚，内膜由单层排列整齐的内皮细胞覆盖，结构完整，无内皮细胞脱落及血细胞黏附；中膜可见多层排列规整的弹力纤维及平滑肌细胞；外膜为较薄的疏松结缔组织，见图1A。模型对照组:血管壁三层结构存在，可见管壁增厚，内膜不光滑且增厚,内皮细胞部分损伤脱落，可见血细胞黏附；中膜弹性纤维及平滑肌细胞增生且排列紊乱，部分平滑肌细胞核与内膜垂直并且有向内膜迁移趋势，可见空泡样结构；外膜细胞增生活跃，细胞核密度增加，见图1B。阳性对照组与牛蒡根水提物高剂量组可明显改善血管内皮损伤，未见内皮细胞脱落及血细胞黏附，弹力纤维排列有序；牛蒡根水提物中剂量组偶有内皮细胞脱落及血细胞黏附，中膜可见空泡样结构；牛蒡根水提物低剂量组仍可见内皮细胞脱落及血细胞黏附，内膜增厚，弹力纤维排列较阳性对照组整齐，见图1C～F。

2.4 牛蒡根水提物对高血压大鼠血管内皮ICAM-1蛋白表达水平的影响光镜下观察ICAM-1阳性表现为胸主动脉内皮细胞胞膜及胞浆内有棕黄色颗粒，见图2；与正常对照组相比，模型对照组ICAM-1表达水平显著增高；阳性对照组及牛蒡根水提物高、中、低剂量组的ICAM-1表达水平低于模型对照组（P＜0.05），牛蒡根高剂量组、阳性对照组与正常对照组相比无明显差异（P＞0.05），见表2。

Tab.1Changes of systolic blood pressure at different time points in six groups表1 各组不同时期收缩压变化(n=10，mmHg，)

Tab.1Changes of systolic blood pressure at different time points in six groups表1 各组不同时期收缩压变化(n=10，mmHg，)

1 mmHg=0.133 kPa；＊＊P＜0.01；a与正常对照组比，b与模型对照组比，P＜0.05

组别正常对照组模型对照组阳性对照组牛蒡根水提物高剂量组牛蒡根水提物中剂量组牛蒡根水提物低剂量组F给药前108.42±2.23 204.13±1.83a 204.21±2.50a 204.64±1.69a 204.86±1.93a 204.47±2.31a 1 406.93＊＊给药后1 d 112.39±1.18 204.58±2.02a 191.34±1.03ab 196.63±1.41ab 200.55±1.73ab 202.45±2.52ab 1 536.70＊＊给药后4 d 110.47±2.28 203.91±2.39a 180.6±1.83ab 186.84±2.76ab 194.02±2.32ab 200.61±1.98b 959.79＊＊给药后7 d 110.89±1.24 201.36±1.72a 168.59±1.36ab 176.42±2.81ab 187.02±2.40ab 194.55±2.21ab 900.52＊＊给药后10 d 112.15±1.48 202.30±2.21a 157.83±6.36ab 167.32±1.68ab 179.26±2.53ab 186.36±2.42ab 396.27＊＊给药后13 d 111.05±1.86 203.91±2.12a 145.23±3.08ab 157.26±2.78ab 170.18±3.12ab 180.22±3.58ab 543.94＊＊组别正常对照组模型对照组阳性对照组牛蒡根水提物高剂量组牛蒡根水提物中剂量组牛蒡根水提物低剂量组F给药后16 d 110.20±1.46 202.51±2.76a 134.70±2.83ab 145.31±3.01ab 162.07±3.44ab 173.39±2.19ab 542.32＊＊给药后19 d 109.79±1.21 201.33±2.56a 126.57±2.05ab 135.87±4.12ab 155.23±2.63ab 167.76±1.64ab 467.45＊＊给药后22 d 110.08±1.77 202.33±2.44a 120.07±1.68ab 126.78±1.18ab 147.36±2.15ab 159.49±1.65ab 525.74＊＊给药后29 d 112.13±1.80 201.49±2.05a 116.03±1.63ab 120.04±1.72ab 136.58±1.69ab 154.46±2.27ab 462.27＊＊给药后36 d 111.47±1.34 202.18±2.27a 112.37±2.12b 115.11±1.89b 130.46±3.44ab 151.79±2.05ab 926.35＊＊给药后42 d 110.83±1.57 201.42±2.01a 112.24±2.03b 115.41±1.08b 129.80±2.42ab 150.09±1.98ab 1 310.41＊＊F 4.41 2.92 1 429.89＊＊1 887.90＊＊1 124.62＊＊807.43＊＊

Tab.2Comparison of expression levels of serum inflammatory cytokines IL-6,CRP and ICAM-1 between six groups表2 各组血清炎症因子IL-6、CRP水平及血管内皮ICAM-1蛋白表达水平比较(n=10，)

Tab.2Comparison of expression levels of serum inflammatory cytokines IL-6,CRP and ICAM-1 between six groups表2 各组血清炎症因子IL-6、CRP水平及血管内皮ICAM-1蛋白表达水平比较(n=10，)

＊＊P＜0.01；a与正常对照组比，b与模型对照组比，P＜0.05

组别正常对照组模型对照组阳性对照组牛蒡根水提物高剂量组牛蒡根水提物中剂量组牛蒡根水提物低剂量组F IL-6（ng/L) 9.16±0.53 39.71±1.11a 10.76±0.21b 11.21±0.34ab 25.24±1.01ab 28.98±1.20ab 983.62＊＊CRP（ng/L) 13.31±0.63 142.91±2.23a 14.50±0.96b 16.23±0.68b 54.34±1.81ab 71.95±1.41ab 6.89＊＊ICAM-1（OD）0.023±0.014 0.189±0.011a 0.038±0.007b 0.050±0.011b 0.102±0.020ab 0.159±0.014ab 131.62＊＊

3 讨论

近些年相关研究证明，血管内皮损伤与高血压的发生发展密切相关。血管内皮细胞内分泌功能强大，其分泌的活性物质如促炎因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管细胞间黏附分子（VCAM-1）、CRP、IL-6、ICAM-1等，抗炎因子一氧化氮（NO）、前列腺素（PG）等。正常情况下，这些因子维持在平衡状态，一旦血管内皮受损，其内分泌功能失调，可导致血管内皮炎性反应增强，从而导致高血压[9]。

CRP水平升高是心血管疾病的重要危险因素[10]，其可通过减少内皮细胞对NO及PG的释放,同时刺激内皮素（ET）-1及ET-1免疫样激活物释放,并促进血管内皮增生、内膜增厚,增加血管重塑阻力，使血管收缩、血压升高[11]。IL-6是由平滑肌细胞、血管内皮细胞等产生的一种多功能细胞因子，其可通过降低血管内皮前列环素水平，增加血管平滑肌细胞Ca2+通透性，使Ca2+含量增高，并使血管紧张素（Ang）Ⅱ受体上调，使血压升高。IL-6还可刺激血小板源生长因子（PDGF)分泌，PDGF可促进成纤维细胞、血管平滑肌细胞增殖，诱导成纤维细胞、巨噬细胞向血管内膜下游走、黏附及血管收缩,从而损伤血管内皮[12]。ICAM-1是炎性反应的可信标志物[13]，正常情况下，ICAM-1很少表达或不表达，在炎症因子、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）等刺激下表达增加，导致血管内皮损伤[14]，ICAM-1可通过介导血管平滑肌细胞增生、分化与迁移，从而导致大量胶原纤维、蛋白多糖等基质的产生，导致管壁增厚、变硬，血压升高[15]。

本实验结果显示L-NNA所致的高血压大鼠血清中炎性因子CRP、IL-6、血管内皮ICAM-1表达均显著高于正常对照组大鼠，提示高血压大鼠血管内皮损伤、中膜平滑肌显著增厚，导致了动脉血管的重构，证实了慢性炎症状态与主动脉内皮损伤及血管重构相关。实验药物牛蒡根水提物高(2.0 g/kg)、中(1.0 g/kg)、低(0.5 g/kg)剂量均可显著降低高血压大鼠收缩压，改善胸主动脉形态结构，并抑制循环血液及血管内皮内炎症因子的表达水平，证明了牛蒡根水提物可通过抑制炎症反应达到保护血管内皮的作用。

综上所述，牛蒡根水提物对高血压大鼠模型具有良好降压和保护血管内皮的作用，其机制可能与减少炎症因子CRP、IL-6及ICAM-1水平，抑制血管壁血细胞及内皮细胞黏附、减轻管壁炎症反应有关。

（图1、2见插页）

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（2014-08-05收稿2014-09-30修回）

（本文编辑闫娟）

Protective effects of aqueous extract of arctium lappa root on vascular endothelial cell injury of hypertensive rats

ZHAO Na1,MA Weihong1△,SU Ying2,ZHAI Zhenli3,QIN Xiaoying4
1 The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guangxi 541001,China;2 Yishui Central Hospital of Linyi;3 The First Hospital of Handan;4 Department of Clinical Medicine,Guilin Medical University△

ObjectiveTo study the protective effects and mechanism of aqueous extract of arctium lappa root on vascular endothelial cell injury in hypertensive rats.MethodsThe hypertensive rat model was induced by N-nitro-L-arginine.Rats were randomly divided into normal control group,model control group,positive control group(aptopril 15 mg/kg), low concentration of aqueous extract of arctium lappa root(0.5 g/kg),medium concentration of(1 g/kg)and high concentration of(2 g/kg)groups.After six weeks of continuous intragastric administration,the systolic blood pressure levels at tail artery were measured at 1,4,7,10,13,16,19,22,29,36 and 42 d after treatment.And other indicators related to inflammatory factors were detected including C-reactive protein(CRP)and interleukin(IL)-6.The intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)level was detected by taking samples of thoracic aorta.Results(1)The systolic blood pressure level at tail artery was significantly lower in aqueous extract of arctium lappa root group than that of model control group(P＜0.05).(2)The aqueous extract of arctium lappa root can significantly improve the vascular endothelial cell injury,suppress vascular endothelial cell loss and blood cell adhesion,and cell proliferation with collagen fibers in muscle membrane.(3)The serum levels of IL-6,CRP and vascular endothelial ICAM-1 were significantly reduced in aqueous extract of arctium lappa root group than that of model control group(P＜0.05).ConclusionAqueous extract of arctium lappa root can significantly improve vascular endothelial cell injury in hypertensive rats.The mechanism may be related to the inhibition of inflammatory cytokines like IL-6,CRP and the expression of ICAM-1,and the improvement of chronic inflammatory response in vascular endothelium of hypertensive rats.

arctium lappa；hypertension；endothelium,vascular；C-reactive protein；interleukin-6；intercellular adhesion molecule-1

R544.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.011

广西中医药民族医药传承创新专项课题(GZLC14-38);2014年国家级大学生创新创业训练计划项目（G201410601005）；广西壮族自治区大学生创新训练项目（201410601019）

1桂林医学院附属医院（邮编541001）；2临沂市沂水中心医院；3邯郸市第一医院；4桂林医学院

赵娜（1988），女，硕士在读，主要从事心血管疾病研究

△通讯作者E-mail:gxgylqlq@163.com